《Frontiers in Microbiology》：The supernatant of Lactiplantibacillus plantarum 25 is more effective than extracellular vesicles in alleviating ulcerative colitis and improving intestinal barrier function
1 引言
溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis, UC）是一种慢性炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease, IBD），其发病涉及遗传易感性、环境因素、肠道微生物群和免疫失调之间的复杂相互作用。当前的治疗策略包括免疫抑制剂和抗炎药物，虽能一定程度缓解症状，但疗效有限且常伴随不良反应。即使在可能发生自发缓解的急性UC中，肠道屏障的持续性破坏和微生物失衡仍会驱动疾病进展。因此，寻找能够有效恢复肠道稳态的新型治疗策略已成为当务之急。
益生菌作为UC管理的候选药物日益受到关注，主要通过调节肠道菌群、增强屏障完整性和调节宿主免疫反应发挥作用。其中，植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）在改善UC症状和修复肠上皮屏障方面显示出显著功效。其保护机制涉及细胞因子介导的免疫调节、紧密连接（Tight Junction, TJ）蛋白的上调以及肠道微生物组成的重塑，共同有助于减轻炎症和促进黏膜愈合。
肠道屏障破坏是UC发病的一个标志。紧密连接蛋白，包括ZO-1、Occludin和Claudins，是维持上皮完整性的重要组成部分。这些蛋白的缺失会损害黏膜防御，允许有害微生物和大分子穿透黏膜并加剧炎症。因此，加强肠道屏障被认为是UC的关键治疗方法。
先前研究表明，特定的植物乳杆菌菌株或其细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）对肠道具有保护作用。例如，源自植物乳杆菌UJS001的EVs可促进M2巨噬细胞极化并调节细胞因子分泌，从而缓解肠道炎症。类似地，植物乳杆菌SC-5通过抑制NF-κB和MAPK信号通路、增强TJ蛋白表达和恢复微生物稳态来减轻葡聚糖硫酸钠（Dextran Sulfate Sodium, DSS）诱导的小鼠结肠炎。这些发现表明，不同的植物乳杆菌衍生成分可能发挥不同的保护机制。
肠道微生物失调是UC的另一个标志。微生物组成的改变可通过内毒素过度产生和促炎通路激活加剧炎症。益生菌，包括植物乳杆菌，已被证明可以抑制病原菌、促进短链脂肪酸（Short-Chain Fatty Acids, SCFAs）产生并恢复微生物多样性，从而有助于肠道稳态。
本研究旨在直接比较LP25衍生的EVs和上清液在急性UC小鼠模型中的治疗效果。研究发现，上清液通过改善生存率、恢复屏障完整性、调节肠道菌群和抑制TLR4/NF-κB信号通路激活，提供了更显著的保护作用。这些发现为植物乳杆菌上清液作为UC的一种经济有效且有前景的治疗选择提供了新的见解。
2 材料与方法
2.1 菌株、上清液和细胞外囊泡制备
植物乳杆菌25（LP25）分离自中国内蒙古的传统发酵乳制品“奶豆腐”，并保藏于中国普通微生物菌种保藏中心（CGMCC No. 31750）。菌株在MRS培养基中于37°C培养72小时，离心后取上清液经0.22 μm滤膜过滤获得LP25上清液。LP25衍生的EVs通过超速离心法从上清液中分离获得。
2.2 DSS诱导的小鼠结肠炎模型
六周龄雄性C57BL/6小鼠适应性饲养一周后，通过饮用含3%（w/v）DSS的水连续7天诱导结肠炎。小鼠随机分为四组：对照组、LP25菌悬液组（B-LP25, 109CFU/mL）、LP25 EVs组（2 mg/kg）和LP25上清液组（250 mg/kg）。所有处理均源自同一LP25培养物以确保生物学一致性。每天记录体重变化并计算疾病活动指数（Disease Activity Index, DAI）。在第13天，收集所有小鼠的结肠组织和粪便样本用于后续分析。另建立次级UC小鼠模型，分别腹腔注射低剂量（1 mg/kg）或高剂量（2 mg/kg）LP25 EVs，或灌胃低剂量（125 mg/kg）或高剂量（250 mg/kg）LP25上清液。
2.3 结肠炎严重程度评估
根据体重变化、DAI评分和结肠长度评估结肠炎严重程度。实验结束时，处死小鼠并测量结肠长度。
2.4 细胞培养
Caco-2细胞以2×106cells/well的密度接种于6孔板。细胞融合度达80–90%时，换用无血清高糖DMEM培养基。细胞用LPS（10 μg/mL）单独或与LP25上清液或EVs共同处理24小时。共处理组分别接受低浓度LP25上清液（L-LP25, 25 μg/mL）、低浓度EVs（L-EVs, 120 μg/mL）、高浓度LP25上清液（H-LP25, 250 μg/mL）或高浓度EVs（H-EVs, 240 μg/mL）处理。
2.5 定量实时PCR
使用Trizol试剂提取总RNA，测定浓度和纯度后合成cDNA。使用SYBR Green Fast qPCR Mix在实时PCR系统上进行qRT-PCR。以β-actin为内参基因，采用2?ΔΔCt法计算基因相对表达水平。
2.6 细胞活力测定
使用CCK-8法测定细胞活力。Caco-2细胞以5,000 cells/well接种于96孔板，贴壁过夜后，用不同浓度的LP25上清液（0.25, 2.5, 25, 250 μg/mL）或EVs（120, 240, 480, 960 μg/mL）处理24小时。孵育后，加入含10% CCK-8的新鲜完全培养基，继续孵育2小时，用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度。
2.7 蛋白质印迹
组织和细胞样本用含PMSF的NP-40裂解缓冲液裂解。测定蛋白浓度后，取等量蛋白（20 μg/lane）进行SDS-PAGE分离，并转印至PVDF膜。膜用5%脱脂牛奶封闭2小时，与一抗4°C孵育过夜，再与二抗室温孵育2小时。最后用ECL成像系统显影，ImageJ软件量化条带强度。
2.8 组织学分析
结肠组织用4%多聚甲醛固定至少24小时，经脱水、透明、石蜡包埋后切片（5 μm厚）。切片脱蜡、水化后进行H&E染色，中性树脂封片后于光学显微镜下观察。
2.9 免疫荧光染色
结肠组织冰冻切片室温平衡40分钟，PBS洗涤后，用0.3% Triton X-100透化20分钟，1% BSA封闭2小时。与一抗（ZO-1, Occludin, Claudin-1）4°C孵育过夜，再与Alexa Fluor 488标记的二抗室温避光孵育2小时。DAPI复染核后，用抗淬灭封片剂封片，荧光显微镜下采集图像。
2.10 微生物群16S rDNA基因测序
粪便样本总基因组DNA提取后，进行16S rRNA基因扩增子测序。测序在Illumina NovaSeq 6000平台上进行，所有测序和生物信息学分析由百趣生物科技有限公司完成。
2.11 Transwell共培养系统
建立Caco-2和RAW 264.7细胞的体外肠道模型。Caco-2细胞（2×105cells/well）接种于Transwell插板（0.4 μm孔径）顶端，分化21天。RAW 264.7巨噬细胞（2×106cells/well）接种于基底外侧室。在基底外侧室加入LPS（1 μg/mL）诱导炎症反应。将低浓度（L-LP25, 25 μg/mL）或高浓度（H-LP25, 250 μg/mL）LP25上清液加入顶端室，孵育18小时。
2.12 LP25上清液的非靶向代谢组学分析
将LP25菌悬液（109CFU/mL）接种于200 mL MRS肉汤中，未接种的MRS肉汤作为对照。37°C、200 rpm振荡培养72小时。培养物离心后取上清液，用PEG-12000在4°C下浓缩。浓缩上清液用BCA法测定蛋白浓度，0.45 μm滤膜过滤后，进行非靶向代谢组学分析。基于代谢组学数据，对所有鉴定到的代谢物进行差异分析。筛选fold change (FC) > 1.5或 < 0.67且p < 0.05的代谢物为显著差异代谢物。使用KEGG数据库进行通路注释和富集分析。
2.13 统计分析
所有统计分析使用GraphPad Prism 10.0进行。数据以均值±标准差表示。两组间比较采用双尾Student’s t检验，多组比较采用单因素或双因素方差分析。p < 0.05认为有统计学意义。对于16S rDNA测序数据，采用Kruskal-Wallis秩和检验和Wilcoxon秩和检验评估组间差异。
3 结果
3.1 LP25上清液显著改善急性UC小鼠的生理指标
与DSS组相比，B-LP25组疾病相关参数无显著改善。而LP25上清液组和LP25 EVs组均显示出生理指标的显著改善。具体而言，LP25上清液组表现出体重增加、DAI评分降低、生存率提高和结肠长度延长。值得注意的是，这些有益效果在上清液组比EVs组更为明显。
3.2 LP25上清液更有效地促进TJ蛋白表达并减轻UC相关组织损伤
LP25衍生的EVs和浓缩上清液均增强了ZO-1、Occludin和Claudin-1的表达，同时降低了α-SMA水平；然而，上清液的治疗效果显著优于EVs。H&E染色显示，NC组组织学结构正常，DSS处理诱导了显著的上皮损伤、炎性细胞浸润和杯状细胞耗竭。在LP25上清液处理的小鼠中，炎症浸润显著减少，杯状细胞密度增加，隐窝结构大部分恢复。相比之下，EVs处理组表现出部分改善，但仍有大量病变存在。免疫荧光分析一致地显示，与DSS组相比，上清液显著增加了TJ蛋白的表达，其效果强于EVs。鉴于LP25上清液在体内外实验中均表现出更优的功效，后续研究调查了其对肠道菌群组成的影响，并通过代谢组学分析探索了潜在的生物活性成分。
3.3 LP25上清液调节UC小鼠的肠道菌群组成
对所有组别的粪便样本进行16S rDNA测序，以研究LP25上清液对肠道微生物组成的影响。在门水平上，对照组以厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidota）为主，这是健康肠道微生物群的典型特征。DSS诱导的结肠炎破坏了这种平衡，导致厚壁菌门减少，脱硫杆菌门（Desulfobacterota）、放线菌门（Actinobacteriota）和微小菌门（Patescibacteria）过度生长。LP25上清液处理，尤其是高剂量，通过增加厚壁菌门和减少促炎菌门（如脱硫杆菌门和放线菌门）逆转了这些改变。在属水平上，DSS处理小鼠中有益细菌（包括毛螺菌属（Ligilactobacillus）、杜波氏菌属（Dubosiella）和阿克曼菌属（Akkermansia））显著减少，而机会性菌属（如脱硫弧菌属（Desulfovibrio）、梭菌属（Clostridium）和厌氧锥形菌属（Anaerotignum））富集。LP25上清液给药以剂量依赖的方式使这些变化正常化，显著富集毛螺菌属和阿克曼菌属，同时抑制致病菌属。LEfSe分析揭示了所有组别中不同的微生物生物标志物。对照组微生物群以拟杆菌纲（Bacteroidia）、Muribaculaceae和毛螺菌属的富集为特征，而DSS组则表现出较高丰度的梭菌纲（Clostridia）和颤螺旋菌目（Oscillospirale），表明微生物失调。相比之下，LP25上清液处理——尤其是高剂量——促进了芽孢杆菌纲（Bacilli）、乳杆菌科（Lactobacillaceae）和乳杆菌相关分类群的富集，表明健康微生物特征的部分恢复。关键分类群相对丰度的分析进一步支持了这些发现。 collectively，这些结果表明LP25上清液通过抑制致病菌群和促进有益乳杆菌相关细菌的重新定植，有效抵消DSS诱导的菌群失调，有助于恢复肠道微生物稳态。
3.4 在LPS诱导的Caco-2细胞中，LP25上清液比EVs更有效地增强紧密连接蛋白表达
鉴于LP25上清液和EVs均能改善体内生理指标，接下来在体外比较了它们对肠上皮屏障功能的影响。用递增浓度的LPS（0, 1, 5, 10, 50 μg/mL）刺激Caco-2细胞24小时，qPCR分析TNF-α mRNA表达显示10 μg/mL时诱导最强，因此后续实验均使用此浓度。CCK-8法评估细胞活力后，选择120 μg/mL和240 μg/mL作为EVs的低、高剂量，25 μg/mL和250 μg/mL作为LP25上清液的低、高剂量，这些浓度对Caco-2细胞无细胞毒性。蛋白质印迹分析表明，与LPS单独处理组相比，LP25 EVs和上清液均显著增加了紧密连接蛋白（包括ZO-1、Claudin-1和Occludin）的表达。值得注意的是，LP25上清液诱导的上调比EVs更显著。免疫荧光成像一致地显示，上清液处理的细胞中ZO-1荧光信号强于EVs处理的细胞，进一步证实了LP25上清液在炎症条件下恢复TJ蛋白表达的优越能力。
3.5 LP25上清液在Caco-2/RAW 264.7共培养模型中保持肠道完整性并抑制TLR4/NF-κB信号通路
首先建立了分化的Caco-2单层细胞，并通过Western blot检测肠道碱性磷酸酶（IAP）和Villin验证了上皮分化成功。在Caco-2/RAW 264.7共培养系统中，LPS（1 μg/mL）刺激显著破坏了上皮完整性，表现为紧密连接蛋白水平降低。用LP25上清液（L-LP25: 25 μg/mL; H-LP25: 250 μg/mL）处理显著恢复了Caco-2细胞中Occludin、Claudin-1、IAP和Villin的表达，显示出强大的屏障保护作用。同时，在基底外侧的RAW 264.7巨噬细胞中，LP25上清液上调了Arg-1表达并抑制了CD86水平，表明其向抗炎M2样表型转变。在机制上，LP25上清液通过减少p65和IκBα的磷酸化，显著抑制了TLR4/NF-κB信号级联的激活，从而抑制了NF-κB的活化。 collectively，这些发现表明LP25上清液通过抑制TLR4/NF-κB介导的信号通路，在上皮-巨噬细胞共培养模型中维持肠道屏障完整性并减轻炎症。
3.6 高分辨率非靶向代谢组学鉴定LP25上清液中的差异代谢物
对浓缩的LP25上清液和MRS对照样本进行非靶向高分辨率代谢组学分析，以表征代谢差异。主成分分析（PCA）显示组间分离明显，无重叠，表明代谢谱存在显著差异。正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）进一步沿预测成分区分了LP25和MRS样本。置换测试证实了OPLS-DA模型的稳健性。火山图显示了显著改变代谢物的分布。在负离子模式下，167种代谢物上调，119种下调；在正离子模式下，169种上调，28种下调。基于fold change排序，将两种离子模式下的前50个差异代谢物（VIP > 1, p < 0.05）映射到KEGG通路。筛选出7种代谢物——D-核糖、组氨酸、乙酰胆碱、琥珀酸、甘油磷酸、5-羟基赖氨酸和乙酰乙酸——作为可能介导LP25作用的关键化合物。其中，乙酰胆碱和琥珀酸尤为引人关注。
4 讨论
溃疡性结肠炎是一种以黏膜屏障破坏、微生物失调和免疫失衡为特征的慢性炎症性疾病。尽管目前的治疗方法如5-氨基水杨酸和皮质类固醇可以缓解症状，但常引起不良反应且不能恢复肠道稳态。益生菌已成为有前景的替代方案。本研究鉴定了一株抗炎菌株LP25，并比较了其细胞外囊泡和培养上清液对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎的影响。结果表明，LP25上清液通过增强体重恢复、延长结肠长度、降低疾病活动指数评分、提高生存率以及保护紧密连接蛋白表达，表现出比EVs更显著的保护作用。这些效应进一步得到其调节肠道菌群组成、富含有益细菌、减少致病菌群、抑制LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎性细胞因子产生以及增强Caco-2/RAW 264.7共培养系统上皮屏障完整性的支持，共同有助于恢复肠道稳态。
UC发病的一个标志是肠道屏障功能破坏，这主要是由于ZO-1、Occludin和Claudin-1等紧密连接蛋白的丢失。与先前研究发现一致，LP25 EVs和上清液均改善了DSS诱导的症状。但上清液显示出更优的功效，显著增强了生存率和TJ蛋白表达，同时降低了α-SMA水平。组织学检查证实了上皮结构的保护，体外实验表明LP25上清液更有效地恢复了LPS刺激的Caco-2细胞中TJ的表达。
UC还以肠道菌群失调为特征，表现为有益细菌减少和致病菌群增加。16S rDNA测序显示，LP25上清液显著增加了乳酸杆菌属（Lactobacillus）、毛螺菌属（Ligilactobacillus）、杜波氏菌属（Dubosiella）和阿克曼菌属（Akkermansia）的丰度，这些是产生短链脂肪酸、支持上皮生长和肠道稳态的菌属。同时，致病菌群如脱硫弧菌属（Desulfovibrio）和梭菌属（Clostridium）显著减少。因此，LP25上清液可能部分通过重塑肠道菌群朝向更有益的组成来缓解UC。
免疫调节是UC发病的另一个关键因素。利用整合上皮细胞和免疫细胞的共培养模型有效模拟了体内上皮-免疫相互作用。本研究发现，LP25上清液显著上调了Caco-2细胞中的紧密连接蛋白，表明屏障完整性改善。同时，在LPS刺激的巨噬细胞中，上清液降低了M1标志物CD86并增加了M2标志物Arg-1，表明其向抗炎表型转变。在机制上，上清液通过减少p65和IκBα的磷酸化抑制了TLR4/NF-κB信号通路。这些发现表明LP25上清液通过增强上皮屏障功能和调节TLR4/NF-κB通路来保护UC。
为了探索这些保护作用的潜在介质，对浓缩的LP25上清液进行了非靶向代谢组学分析，揭示了7种代谢物，包括乙酰胆碱和琥珀酸。乙酰胆碱是一种关键的神经递质和肠道生理调节剂，在IBD患者的结肠组织中显著耗竭。琥珀酸则可以通过SUCNR1刺激簇细胞分泌IL-25，启动包括ILC2激活和簇细胞-杯状细胞分化的2型免疫反应，从而支持上皮修复和减少炎症。
考虑到这些代谢物介导的效应，本研究比较了LP25衍生的EVs和上清液在DSS诱导的UC小鼠模型中的治疗效果。上清液显示出比EVs更显著的保护作用。虽然有益肠道细菌的EVs可以通过生物活性化合物增强肠道屏障完整性，但它们主要作为递送载体发挥作用。在急性UC模型中，其疗效有限，可能反映了它们更适合慢性背景。相比之下，上清液具有更高的稳定性、更容易获取和一致的生物活性，使其成为一种更易获得和可靠的治疗方法。
尽管我们的研究结果表明LP25上清液有效缓解了小鼠急性溃疡性结肠炎的症状并调节了肠道菌群，但其精确的潜在机制仍未完全阐明。未来的研究有必要确定负责这些效应的关键生物活性代谢物，并更详细地阐明其分子通路。尽管如此，基于益生菌衍生代谢物的治疗策略为溃疡性结肠炎的治疗提供了一个有前景和创新的方向，值得进一步研究。
5 结论
总之，在DSS诱导的结肠炎小鼠模型中，LP25上清液显著减轻了UC小鼠结肠紧密连接蛋白的破坏，对肠道损伤产生了保护作用，并与肠道菌群组成的改善相关。在体外共培养模型中，LP25上清液降低了巨噬细胞表面标志物CD86的表达，增加了Arg-1和TJ蛋白的表达，并抑制了TLR4/NF-κB信号通路的激活。这些发现共同凸显了益生菌衍生代谢物作为溃疡性结肠炎辅助治疗的有前景候选物的潜力。
