《Cellular and Molecular Life Sciences》：Cathelicidin-Ka, the first frog-derived TLR2 and TLR4 agonist, induces macrophage activation and promotes inflammation
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本研究針對TLR靶向免疫治療中激動劑易引發過度炎症的問題，從斑腿泛樹蛙（Kaloula pulchra）皮膚中鑑定出首個蛙源TLR2/TLR4雙重激動劑Cathelicidin-Ka（Cath-Ka）。研究發現Cath-Ka可通過激活TLR2/4-MyD88-MAPKs信號通路，顯著促進巨噬細胞增殖、M1極化、遷移、吞噬及胞內細菌清除能力，並誘導炎性單核/巨噬細胞向腹腔募集。C-末端酰胺化修飾的突變體（Cath-Ka-5）活性更強，為TLR相關感染性疾病提供了新型免疫調控候選分子。
在微生物耐藥性日益嚴峻的全球健康挑戰下，通過調動宿主自身免疫系統來對抗感染的免疫治療策略展現出巨大潛力。Toll樣受體（Toll-like receptors, TLRs）作為先天免疫的關鍵模式識別受體，其激動劑能夠激活免疫細胞，尤其是巨噬細胞，從而清除病原體。然而，現有TLR激動劑（如單磷酰脂質A、咪喹莫特等）雖已應用於疫苗佐劑或疾病治療，但往往伴隨過度炎症反應的風險，限制其臨床應用。因此，開發具有適度免疫激活活性、來源新型且作用機制明確的TLR激動劑成為當前研究的重點。
宿主防禦肽（Host defense peptides, HDPs）因其獨特的抗菌機制和免疫調節功能被視為傳統抗生素的潛在替代品。兩棲動物皮膚分泌物富含結構多樣、生物活性廣泛的Cathelicidin家族肽類，多數已被報導具有脂多糖（LPS）中和、抗菌及抗炎活性。例如，Cathelicidin-PY可通過破壞細菌膜和阻斷TLR4介導的炎症反應發揮作用。然而，對於非哺乳動物來源的HDPs，其免疫調節機制，特別是作用靶點，仍很大程度上未知。斑腿泛樹蛙（Kaloula pulchra）是廣泛分佈於東南亞和中國南方的常見物種，其皮膚分泌物含有多種生物活性成分，但相關研究甚少。
為此，發表在《Cellular and Molecular Life Sciences》上的這項研究，從斑腿泛樹蛙皮膚中發現了一種新型Cathelicidin肽——Cathelicidin-Ka（Cath-Ka），並深入探究了其免疫刺激特性及分子機制。研究人員發現，Cath-Ka雖無直接殺菌活性，卻能作為TLR2和TLR4的特異性激動劑，有效激活巨噬細胞，促進其向M1表型極化，增強吞噬和胞內細菌殺傷功能，並通過誘導趨化因子產生促進免疫細胞募集。進一步機制研究表明，Cath-Ka通過直接結合TLR2和TLR4，激活下游MyD88-MAPKs信號通路，而非NF-κB通路，從而調控一系列免疫相關基因表達和細胞功能。值得注意的是，對Cath-Ka進行C末端酰胺化修飾得到的突變體（Cath-Ka-5）展現出更強的免疫調節活性。這些發現不僅揭示了首個蛙源TLR2/TLR4激動劑的作用機制，也為治療TLR相關感染性疾病（如膿毒症）提供了新的候選分子。
研究團隊主要運用了以下幾種關鍵技術方法：從斑腿泛樹蛙皮膚分泌物中通過轉錄組測序和LC-MS/MS鑑定Cath-Ka肽序列；合成肽及其突變體並通過圓二色譜分析其二級結構；利用體外細胞模型（小鼠巨噬細胞系RAW264.7）和體內動物模型（BALB/c小鼠）評估肽的免疫調節活性；通過流式細胞術、ELISA、RT-qPCR、Western blot等手段檢測細胞表型、細胞因子分泌及信號通路激活；採用表面等離子共振成像、競爭性結合實驗、Pull-down、細胞熱位移分析等技術驗證Cath-Ka與TLR2/TLR4的直接相互作用；並通過分子對接預測相互作用模式。
Cath-Ka的序列與結構特徵
研究人員從斑腿泛樹蛙皮膚轉錄組中克隆得到Cath-Ka的cDNA序列，其編碼的前體蛋白含182個氨基酸，成熟肽為32個氨基酸（AGFLGSGHKHPVEAHASCIACIIEELGKVSRG），理論等電點為7.04，分子量為3274.76 Da。質譜分析證實合成肽的分子量為3272.68 Da，經二硫蘇糖醇處理後變為3274.69 Da，表明肽內第18和21位的半胱氨酸之間形成了一個分子內二硫鍵。LC-MS/MS分析在蛙皮膚分泌物中檢測到Cath-Ka的氨基酸序列，證實其為天然分泌的肽。圓二色譜分析顯示，Cath-Ka在水溶液中呈無規則捲曲結構，而在SDS膠束環境中呈現典型的α-螺旋結構，且該結構在不同溫度下（25-90°C）保持穩定。
Cath-Ka誘導小鼠腹腔細胞激活
體內實驗表明，腹腔注射Cath-Ka（5 mg/kg）後2小時和4小時，小鼠腹腔灌洗液中的遷移細胞數量以及IL-1β、IL-6、TNF-α和CXCL2等炎性細胞因子的水平均顯著時間依賴性增加。儘管Cath-Ka本身在50μM濃度下對大腸桿菌（E. coli）和金黃色葡萄球菌（S. aureus）無直接抗菌活性，但腹腔細胞的細菌吞噬和胞內殺傷能力卻顯著增強。流式細胞術分析進一步揭示，Cath-Ka注射後，腹腔內髓系細胞（CD45hiCD11b+）、炎性單核細胞（CD45hiCD11b+Ly6ChiF4/80low）、巨噬細胞（CD45hiCD11b+Ly6ChiF4/80hi）和中性粒細胞（CD45hiCD11b+Ly6ClowLy6G+）的比例顯著升高，同時外周血中的炎性單核細胞和中性粒細胞比例也有所增加。
Cath-Ka促進的細胞遷移主要與巨噬細胞相關
Trans-well遷移實驗顯示，Cath-Ka能直接誘導小鼠骨髓來源中性粒細胞和RAW264.7巨噬細胞的遷移，且對巨噬細胞的趨化作用更強。有趣的是，在與經Cath-Ka預處理的巨噬細胞共培養體系中，中性粒細胞的遷移數量幾乎是無巨噬細胞組的三倍，表明Cath-Ka強大的體內中性粒細胞趨化作用部分依賴於巨噬細胞。RT-qPCR和ELISA結果證實，Cath-Ka處理能顯著上調巨噬細胞多種趨化因子（如CCL4、CXCL2、CXCL9）的mRNA和蛋白（CXCL2）表達水平，且其誘導CXCL2的能力強於LPS。
Cath-Ka促進巨噬細胞激活和M1極化
形態學觀察發現，Cath-Ka處理的RAW264.7細胞體積增大，由球形變為延展貼壁形態，且細胞數量增加，提示其有促增殖作用。RT-qPCR和ELISA檢測顯示，Cath-Ka能劑量依賴性上調誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎介質的mRNA和蛋白表達，但不影響抗炎細胞因子IL-10。與LPS相比，Cath-Ka誘導這些細胞因子的能力較弱。多粘菌素B預處理實驗排除了內毒素污染導致細胞激活的可能性。Cath-Ka還能濃度依賴性增加細胞內活性氧（ROS）水平。流式細胞術分析表明，Cath-Ka處理後，巨噬細胞M1型標誌分子MHC II、共刺激分子CD80和CD86的表達上調，而M2型標誌CD206無明顯變化，說明Cath-Ka促進巨噬細胞向M1表型極化。
Cath-Ka增強巨噬細胞的吞噬和胞內細菌殺傷活性
通過FITC-葡聚糖和中性紅攝取實驗，證實Cath-Ka能增強巨噬細胞的內吞能力。大腸桿菌吞噬和胞內殺傷實驗進一步表明，Cath-Ka處理後，巨噬細胞吞噬的細菌數量增加，同時胞內存活細菌數量顯著減少。透射電鏡觀察為這一過程提供了形態學證據：感染後1小時，Cath-Ka處理的細胞內可見更多細菌被包裹在囊泡中；感染後3小時，處理組細胞內出現細菌完全降解的跡象，而對照組未見此現象，證實Cath-Ka能促進巨噬細胞對細菌的清除。
Cath-Ka直接結合TLR2和TLR4
流式細胞術顯示FITC標記的Cath-Ka能劑量依賴性地與RAW264.7細胞結合。抑制劑實驗發現，TLR2抑制劑C29和TLR4抑制劑TAK-242能特異性抑制Cath-Ka誘導的TNF-α或IL-1β產生，而其他TLR或PRR抑制劑無此作用。競爭性ELISA實驗表明，Cath-Ka預處理可部分抑制LTA或LPS誘導的TNF-α產生。表面等離子共振成像分析直接證實Cath-Ka與TLR2和TLR4具有高親和力結合，平衡解離常數（KD）分別約為108 nM和192 nM，但不結合MD2、LPS或LTA。天然聚丙烯酰胺凝膠電泳和Pull-down實驗同樣支持Cath-Ka與TLR2/TLR4的直接結合。細胞熱位移分析結果顯示，Cath-Ka能顯著提高TLR2和TLR4的熱穩定性，進一步證實了它們之間的直接相互作用。
Cath-Ka激活TLR2/4-MyD88-MAPKs信號通路
Western blot結果表明，Cath-Ka處理RAW264.7細胞後，TLR2、TLR4及其下游適配蛋白MyD88的表達在1小時開始增加，4小時達到峰值。同時，ERK、p38和JNK的磷酸化在刺激後0.5-1小時內即被強烈誘導，最高磷酸化水平出現在0.5小時。這種激活作用呈劑量依賴性。值得注意的是，Cath-Ka未引起NF-κB p65亞基的核轉位，這與其較弱誘導TNF-α的現象一致。預先加入C29或TAK-242可顯著抑制Cath-Ka引起的信號蛋白磷酸化及相關基因表達上調。此外，ERK抑制劑U0126、p38抑制劑SB203580和JNK抑制劑SP600125均能抑制Cath-Ka促發的細胞增殖、NO/細胞因子產生、細菌吞噬及殺傷功能。體內實驗也證實，腹腔注射Cath-Ka可上調腹腔細胞中TLR2、TLR4、MyD88以及磷酸化ERK、p38和JNK的水平。
Cath-Ka的N末端殘基、二硫鍵和淨電荷對其功能影響顯著
分子對接預測顯示，Cath-Ka通過其N末端的四個殘基與TLR4的Glu313、Glu264等多個殘基形成14個疏水相互作用，並與Arg234、His506、Gln482形成3個氫鍵。據此設計並合成了一系列Cath-Ka類似物。功能比較發現，去除分子內二硫鍵的Cath-Ka-1以及N末端突變的Cath-Ka-2至Cath-Ka-4均喪失或降低了改變巨噬細胞形態、促進增殖和誘導TNF-α產生的能力。然而，C末端酰胺化的突變體Cath-Ka-5對巨噬細胞功能的調控作用強於原始肽。
研究結論與意義
該研究首次從斑腿泛樹蛙皮膚中鑑定出Cathelicidin-Ka，它作為首個報道的蛙源TLR2和TLR4特異性激動劑，雖無直接殺菌活性，卻能通過激活TLR2/4-MyD88-MAPKs信號軸，有效促進巨噬細胞M1極化、增殖、遷移、炎性因子/趨化因子釋放、ROS產生、吞噬及胞內細菌清除能力，並在體內招募炎性免疫細胞至感染部位。其作用機制涉及與TLR2/TLR4的直接結合，並競爭性幹擾TLR4/MD2-LPS複合物形成，可能緩解LPS引起的過度炎症。結構功能關係研究表明，其N末端殘基、分子內二硫鍵和淨電荷對其活性至關重要，C末端酰胺化修飾可增強其免疫調節功能。這項工作不僅揭示了首個蛙源TLR2/TLR4激動劑的獨特免疫激活機制，為理解兩棲動物宿主防禦肽的免疫調節功能提供了新視角，也為開發治療TLR相關感染性疾病（如膿毒症）的新型免疫調節劑提供了有前景的候選分子。Cath-Ka及其活性增強突變體有望在免疫抑制狀態或特定胞內感染中，通過特異性激活TLR2/4信號，幫助恢復免疫平衡，同時避免引發過度炎症反應。
