《Cellular and Molecular Life Sciences》：USP8-mediated mitochondrial regulation in osteoclasts is essential for skeletal development
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本研究聚焦于去泛素化酶USP8在破骨细胞中的新型功能。为解决骨骼发育异常中蛋白质调控机制不清的问题，研究人员揭示了USP8通过稳定Parkin蛋白、调控线粒体功能（包括OXPHOS、线粒体自噬）和活性氧（ROS）平衡，从而保障破骨细胞分化和骨吸收活性。更重要的是，发现USP8缺陷的破骨细胞会分泌炎症因子（如Ccl5, Cxcl11），非自主性地抑制邻近软骨细胞和成骨细胞分化，导致生长板结构异常和小梁骨骨量减少。该研究阐明了USP8在协调骨微环境中的核心作用，为骨骼疾病治疗提供了新靶点。
骨骼并非一成不变的坚硬结构，而是一个充满活力的组织，在其一生中不断进行重塑。这一过程的平衡由骨形成细胞（成骨细胞）和骨吸收细胞（破骨细胞）共同维持。一旦平衡被打破，便会导致诸如骨质疏松症等骨骼疾病。近年来，蛋白质的翻译后修饰，尤其是泛素化及其可逆过程——去泛素化，被发现在调控骨细胞功能中扮演着关键角色。去泛素化酶（DUBs）能够逆转泛素化过程，从而影响靶蛋白的稳定性、定位和活性。尽管一些DUBs已被证实参与骨代谢，但去泛素化酶8（USP8）在骨骼系统，特别是在破骨细胞中的具体功能，仍是一个未知的领域。这项发表在《Cellular and Molecular Life Sciences》上的研究，正是为了解开USP8在破骨细胞生物学和骨骼发育中的神秘面纱。
研究人员综合利用了生物信息学分析、条件性基因敲除小鼠模型、细胞生物学、分子生物学以及高通量测序等多种关键技术方法。研究队列主要使用了在破骨细胞中特异性敲除Usp8基因的小鼠（Usp8Ctsk）及其同窝对照小鼠。关键实验技术包括：微型电子计算机断层扫描（microCT）用于骨微结构分析；组织学（如HE、TRAP、Safranin O染色）和免疫组织化学用于观察组织形态和蛋白定位；体外破骨细胞分化培养及骨吸收陷窝分析；流式细胞术分析细胞群体；蛋白质免疫印迹（Western Blot）和免疫共沉淀（Co-IP）分析蛋白表达与相互作用；RNA测序（RNA-seq）进行转录组分析；以及线粒体功能检测（如MitoTracker, TMRE, ROS水平测定）等。
USP8在破骨细胞中高表达
通过对公共基因表达数据库（GEO）的分析，研究人员发现USP8在破骨细胞中表达量显著高于其他USP家族成员，并且在其分化过程中表达上调。免疫荧光和免疫组化结果证实，USP8蛋白在成熟的破骨细胞胞质中富集，部分定位于密封区。
破骨细胞特异性敲除Usp8小鼠表现出骨骼发育异常
通过将Usp8fl/fl小鼠与组织蛋白酶K-Cre（Ctsk-Cre）小鼠交配，成功构建了破骨细胞特异性敲除Usp8的小鼠（Usp8Ctsk）。这些小鼠从2周龄开始出现严重的生长迟缓和身材矮小，肢体长度显著缩短。MicroCT分析显示，Usp8Ctsk小鼠的小梁骨骨量显著降低，但皮质骨厚度却增加。组织学分析进一步证实了胫骨远端小梁骨的减少，并且TRAP（抗酒石酸酸性磷酸酶）染色显示的破骨细胞数量也明显减少。血清骨吸收标志物CTx-I水平以及胫骨中破骨细胞标志基因（Acp5, Ctsk, Nfatc1）的mRNA表达均下降。
USP8是破骨细胞分化和骨吸收所必需的
体外实验表明，从Usp8Ctsk小鼠分离的骨髓源性巨噬细胞（BMMs）分化形成的破骨细胞数量、TRAP活性、骨吸收陷窝面积以及破骨细胞标志基因的表达均显著降低。在破骨细胞前体细胞系RAW 264.7中敲低Usp8表达，产生了更为严重的破骨细胞分化缺陷。流式细胞术分析发现，小鼠骨髓中的破骨细胞前体细胞频率并无显著变化，表明USP8主要影响破骨细胞的分化过程，而非其谱系定向。
USP8调控破骨细胞的炎症反应和线粒体功能
对对照组和Usp8敲低组破骨细胞进行RNA测序分析发现，Usp8缺陷导致458个基因上调，58个基因下调。基因集富集分析（GSEA）显示，与炎症反应、活性氧（ROS）信号相关的通路被激活，而与线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）相关的通路被抑制。这表明USP8缺失引发了强烈的炎症反应并破坏了线粒体能量代谢。
USP8缺陷破坏破骨细胞线粒体功能
蛋白质免疫印迹结果显示，Usp8缺陷的破骨细胞中，线粒体复合体I的一个关键亚基NDUFB8的蛋白水平显著降低。功能实验证实，这些细胞的线粒体数量、膜电位、mtDNA/nDNA比率均下降，而细胞内ROS水平和pH值则升高。同时，线粒体自噬关键蛋白Pink1和Parkin的表达也减少，提示线粒体自噬活动受损。这些线粒体功能障碍最终导致了骨吸收活性的下降。
USP8通过稳定Parkin调控破骨细胞发育
免疫共沉淀实验证明USP8与Parkin之间存在相互作用。在存在蛋白酶体抑制剂MG132的情况下，Usp8缺陷细胞中Parkin的泛素化水平升高，表明USP8通过去泛素化作用稳定Parkin蛋白。救援实验发现，在Usp8敲低的破骨细胞中过表达全长的USP8（USP8FL）可以挽救其分化缺陷，而缺失C端DUB结构域的催化失活突变体（USP8N）则不能。有趣的是，过表达Parkin也能部分挽救Usp8缺陷导致的破骨细胞分化受损，说明USP8至少部分通过Parkin来调控破骨细胞发育。
Usp8Ctsk破骨细胞分泌抑制成骨和软骨形成的因子
组织学分析显示，Usp8Ctsk小鼠生长板的静止、增殖和肥大区软骨细胞结构紊乱。为排除USP8在软骨细胞中直接作用的可能性，研究人员构建了他莫昔芬诱导的软骨细胞特异性敲除Usp8小鼠（Usp8Col2aERT），发现这些小鼠并未出现明显的骨骼异常，表明生长板表型并非由软骨细胞自主性缺陷引起。随后，研究人员收集了对照组和Usp8敲低组破骨细胞的条件培养基（CM）。将shUSP8-CM用于野生型软骨前体细胞的软骨形成培养或野生型骨髓间充质干细胞（BMSCs）的成骨分化培养时，分别抑制了软骨形成（蛋白聚糖合成减少，软骨标志基因表达下降）和成骨分化（碱性磷酸酶活性降低，矿化结节减少，成骨标志基因表达下降）。体内实验也证实Usp8Ctsk小鼠生长板中肥大软骨细胞（胶原蛋白X阳性）和骨小梁上的成熟成骨细胞（骨钙素阳性）数量减少。RNA测序数据筛选出Usp8缺陷破骨细胞中上调表达的前35个分泌蛋白编码基因，其中许多是炎症细胞因子和趋化因子（如Ccl5, Cxcl11, Cnn2, Tnfaip2, Oas2），它们可能是抑制软骨形成和成骨作用的因子。
本研究结论部分强调，USP8是破骨细胞分化和骨吸收活性的关键内在调节因子，其机制主要通过稳定Parkin、维持线粒体功能（OXPHOS）和线粒体自噬、调控ROS和pH稳态来实现。更为重要的是，研究揭示了一个前所未有的非细胞自主性功能：USP8缺陷的破骨细胞通过上调分泌特定的炎症因子，改变了骨微环境，从而抑制了邻近的成骨细胞和软骨细胞的功能，最终导致骨骼发育异常。这种由破骨细胞主导的、通过分泌信号协调骨骼形成的机制，深化了对骨细胞间通讯的理解。讨论部分指出，该发现不同于典型的骨质疏松或骨硬化症，而是揭示了一种由破骨细胞功能紊乱导致的独特骨骼发育不全表型。鉴于USP8小分子抑制剂已在肿瘤学领域进行临床前开发，本研究为探索将其用于调节骨代谢、治疗骨质疏松等骨骼疾病提供了全新的策略和理论依据，凸显了USP8在骨骼生物学中的核心地位和潜在治疗价值。
