质子放射治疗在胶质母细胞瘤治疗中具有保护免疫系统的优势。质子治疗能够减轻辐射引起的淋巴细胞减少症

《International Journal of Radiation Oncology*Biology*Physics》：Proton radiotherapy offers immune-sparing benefits in glioblastoma treatment Proton therapy reduced radiation-induced lymphopenia

胶质母细胞瘤（GB）和X射线放疗引发淋巴细胞减少，影响预后和抗肿瘤免疫。本研究通过GL261肿瘤模型和正常小鼠，对比X射线和质子束对脑照射后外周免疫细胞的影响，发现质子治疗引起的淋巴细胞减少更轻，且机制可能与生物学效应相关，为胶质瘤免疫治疗联合放疗提供依据。

　　

J. Coupey|T.N. Pham|J. Toutain|V. Ivanova|E.S. Hue|C. Helaine|A. Ismail|R. Saulnier|G. Simonin|M. Rousseau|C. Moignier|J. Thariat|S. Valable

法国卡昂诺曼底大学，法国国家科学研究中心（CNRS），诺曼底大学，ISTCT UMR 6030，CYCERON联合项目，F-14000 卡昂，法国

摘要

目的

胶质母细胞瘤（GB）和基于X射线的放射治疗会导致淋巴细胞减少，这会恶化预后并削弱抗肿瘤免疫力。质子治疗由于其剂量学特性能够保护健康脑组织，因此可以作为减少放射毒性的替代方案。本研究探讨了X射线或质子对脑部照射后淋巴细胞减少的影响。

方法和材料

我们使用携带GL261肿瘤的小鼠和无肿瘤小鼠模型，在脑部照射后评估了各种淋巴细胞和髓系细胞的数量，同时测量了脑部照射的体积、射线方向，并通过流式细胞术分析了淋巴细胞减少的发生时间。

结果

在胶质母细胞瘤小鼠模型中，无论是肿瘤本身还是放射治疗都导致了淋巴细胞减少。无肿瘤小鼠在X射线照射后12小时内就出现了严重的淋巴细胞减少，表现为CD45⁺CD3⁺淋巴细胞、CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺ T细胞、CD3^-B220⁺ B细胞以及CD45⁺CD11b⁺髓系细胞、CD11b⁺Ly6C⁺单核细胞和CD11b⁺Ly6G⁺中性粒细胞减少了50%。髓系细胞亚型在第二天恢复，而淋巴细胞的恢复则取决于细胞类型。使用侧向X射线束未能改变循环中的淋巴细胞计数。脑部、颈部淋巴结（CLN）和脾脏中的免疫细胞定量显示，X射线照射后CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺ T细胞和CD3^-B220⁺ B细胞数量减少。质子照射导致循环中的淋巴细胞减少了15%，但髓系细胞没有变化。质子照射还减少了CLN中的CD3⁺CD4⁺ T细胞和CD3^-B220⁺ B细胞，但对脾脏没有影响。血浆中的IL-1和MIP家族细胞因子水平与两种粒子照射后的白细胞变化相关。

结论

我们发现质子治疗引起的淋巴细胞减少程度低于X射线照射，推测其原因可能与生物学过程有关，而不仅仅是循环中淋巴细胞暴露减少。这可能为将免疫疗法纳入胶质母细胞瘤的治疗提供依据。

部分内容摘录

概述

了解脑部照射如何影响循环免疫系统有助于制定改进脑肿瘤治疗的策略。这包括将照射与免疫疗法结合，并调整临床方案以恢复淋巴细胞或增强抗肿瘤T细胞。

伦理声明

本研究遵循现行欧洲法规，并获得了动物伦理委员会的批准。

研究设计

首先，在胶质母细胞瘤C57BL/6雌性小鼠模型（Janvier实验室，法国）中，在X射线脑部照射期间和之后收集了外周血样本（n=5）。然后，我们评估了X射线（n=20）或质子（n=20）照射对无肿瘤小鼠外周免疫系统的影响。同时，在同一无肿瘤模型中，还研究了

垂直照射

X射线照射在麻醉状态下以2Gy/min的剂量分次进行，每次2.5Gy。八只对照组（CTL）小鼠也接受了麻醉但未接受照射。小鼠在70%N₂/30%O₂环境中使用5%异氟醚诱导麻醉并维持麻醉，每天两次，连续四天，总剂量达到20Gy。分为两组：半球照射（H）和全脑照射（WB），照射剂量均为2Gy/min。治疗计划使用

血液样本

在脑部照射后不同时间点采集小鼠的外周全血样本。根据文献和实践指南^{25,26,27，使用无菌采血针（GR-4MM，Goldenrod动物采血针，BiosebLab）从下颌静脉采集110μL血液。血液样本（20μL）被转移到96孔V底板上，然后用1X红细胞裂解缓冲液（00433357，ThermoFisher）处理两次。}

磁共振成像

动物在70%N₂/30%O₂环境中使用2%异氟醚麻醉，脑部磁共振成像（MRI）在脑部照射后第35天进行（Bruker，Cyceron，卡昂，法国）。采用T2加权序列（RARE=8，TR/TE=5000/56msec，平均次数=2，FOV=20*20mm，空间分辨率=0.078*0.078mm，20层，每层厚度0.5mm，采集时间=4分钟）。三名不知道实验组情况的人员对脾脏体积进行了测量。

免疫组化

在D₄₅天，小鼠在接受丁丙诺啡注射（0.05mg/kg）后深度麻醉，并通过心脏灌注肝素/生理盐水溶液20分钟。取出大脑和脾脏并冷冻在异戊烷中。制备20μm厚的脑切片并储存在-80°C。切片重新水化后，用PBS/0.1%Tween/0.5%Triton/3% BSA封闭2小时，然后在4°C下用PBS/0.1%Tween/0.5%Triton/1%BSA中的一级抗体孵育过夜。

X射线脑部照射在GL261肿瘤模型中引起严重的淋巴细胞减少

我们首先研究了脑肿瘤背景下X射线脑部照射后循环免疫细胞的变化。我们使用了携带GL261肿瘤的小鼠模型（图1A）。如预期，肿瘤随时间增长，这一点通过MRI得到证实。X射线全脑放疗显著抑制了肿瘤生长（p<0.0001）（图1B）。对照组小鼠的体重稳定，而未经治疗的肿瘤小鼠

讨论

在脑肿瘤的研究中，我们的研究表明，接受X射线照射的胶质母细胞瘤小鼠在照射方案第2天（10Gy）就表现出显著的淋巴细胞减少，这种减少持续到第7天，且未恢复到对照组水平。这一发现与Piotrowksi等人（2018年）的研究结果一致，他们的研究也显示X射线脑部照射后会出现全身性淋巴细胞减少；同时与Ghosh等人（2023年）的研究结果一致，尽管我们的数据没有显示出

利益冲突声明

作者声明与本手稿无关的任何利益冲突。

致谢

本工作得到了法国国家科学研究中心（CNRS）通过80?Prime计划的支持；诺曼底地区（编号00129360-22E04690）的支持；抗癌联盟（Ligue contre le Cancer）的支持；PAUSE-ANR Ukraine计划（UKRAINE紧急基金 – 法国科学院和ANR-22-PAUK-0033-01/ANR-23-PAUK-9033-01）的支持；以及法国国家研究机构“Investissements d’Avenir”（编号ANR-10-EQPX1401）的支持。部分工作在France Life Imaging网络设施上进行（资助编号ANR-11-INBS-0006）。