《Transboundary and Emerging Diseases》：Establishment and Evaluation of a Multicolor Latex Microsphere-Based Lateral Flow Immunoassay for the Simultaneous Detection of Antibodies Against African and Classical Swine Fever Viruses
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本文开发了一种创新的多色乳胶微球侧向层析免疫分析技术（LFIA），可在15分钟内通过红（ASFV）、蓝（CSFV）色条带直观区分非洲猪瘟（ASF）与经典猪瘟（CSF）抗体，灵敏度达1:256，与商品化ELISA试剂盒高度一致（Kappa值分别为0.986和0.918），为现场快速诊断（POCT）和疫病防控提供了高效工具。
引言：疫病诊断的迫切需求
非洲猪瘟（ASF）和经典猪瘟（CSF）是严重影响全球养猪业的两种重大动物疫病，其临床症状高度相似（如高热、腹泻、出血性病变），但防控策略截然不同：ASF无有效疫苗，依赖扑杀和生物安全措施；CSF可通过疫苗接种控制，但免疫失败风险存在。两种疫病均为世界动物卫生组织（WOAH）法定通报疾病，快速准确的鉴别诊断对疫情控制至关重要。现有实验室方法（如PCR、ELISA）虽精准，但耗时长、需专业设备，难以满足现场检测需求。
技术突破：多色乳胶微球LFIA的设计与优化
研究团队通过大肠杆菌表达系统成功获得ASFV截短p72蛋白（34 kDa）和CSFV截短E2蛋白（27 kDa），Western blot和间接ELISA验证其良好抗原性。利用EDC/NHS活化羧基，将p72、E2和鸡IgY（CIgY）分别偶联至红色（RLM）、蓝色（BLM）和黑色（BkLM）乳胶微球，形成p72@RLM、E2@BLM和CIgY@BkLM免疫探针。动态光散射（DLS）显示偶联后微球粒径显著增大（如p72@RLM从297 nm增至505 nm），Zeta电位变化（如从-22.57 mV变为-10.21 mV），证实偶联成功。通过沉降实验优化蛋白偶联浓度（p72和E2为50 μg/mL，CIgY为62.5 μg/mL）。
检测机制与性能验证
检测条带设计：硝酸纤维素（NC）膜上依次固定p72（T1线，ASFV）、E2（T2线，CSFV）和山羊抗鸡IgY（C线，质控）。样本中抗体与探针结合后，通过毛细作用迁移，ASFV抗体在T1线形成红色条带，CSFV抗体在T2线形成蓝色条带，CIgY@BkLM在C线形成黑色条带作为内参。灵敏度测试显示该方法对ASFV和CSFV抗体的检测限均为1:256，与商品化ASFV ELISA试剂盒相当，但对CSFV的检测灵敏度较ELISA提升4倍（1:64 vs. 1:256）。特异性实验证实与猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、伪狂犬病毒（PRV）、O型口蹄疫病毒（FMDV-O）等常见猪病原体无交叉反应。批内和批间重复性试验结果一致，表明方法稳定可靠。
临床样本验证与应用前景
180份临床血清样本测试显示，与商品化ELISA试剂盒相比，ASFV和CSFV抗体检出的一致性Kappa值分别为0.986和0.918，具有极佳诊断准确性。该方法仅需10 μL样本、15分钟即可完成检测，无需专业设备，尤其适用于养殖场现场快速筛查、引种检疫及疫苗免疫效果评估。未来可扩展至其他猪病病原（如猪圆环病毒2型、猪支原体）的多联检测，为动物疫病综合防控提供技术支撑。
