《Advanced Healthcare Materials》：Nano-Engineered Titanium Implants Loaded With Gingival Fibroblasts-Derived Microvesicles Enhance Early Osseointegration And Soft Tissue Attachment In Vivo
1 引言
钛牙科种植体的长期成功不仅依赖于可靠的骨结合（Osseointegration），还需要形成良好的种植体周围软组织密封（Peri-implant Soft Tissue Seal），以抵御口腔内微生物丰富的挑战性环境。种植体周围软组织健康不佳和/或骨吸收等并发症，往往始于不充分的软组织密封，这易导致细菌侵入、炎症和种植体周围疾病的发生。因此，优化种植体表面特性，特别是微观和宏观设计，以获得更具弹性的软组织附着，引起了越来越多的关注。
纳米尺度的形貌修饰，如钛纳米管（TNTs）和钛纳米孔（TNPs），可以模拟细胞外基质，影响结缔组织细胞的粘附、增殖和分化。其中，TNPs为生物活性纳米结构设计提供了一种可扩展且可控的方法，并在促进体内骨结合方面显示出潜力。然而，它们与细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）在协同增强软组织愈合方面的潜力尚未完全阐明。
细胞外囊泡是由几乎所有细胞类型分泌的膜结合纳米颗粒，根据其生物发生大致分为三类：凋亡小体、微囊泡（Microvesicles, MVs）和外泌体（小EVs，通常<200 nm）。大EVs，包括凋亡小体和微囊泡（100–1000 nm），由质膜向外出芽形成，而外泌体则起源于内体膜，并在多囊体与质膜融合时释放。微囊泡携带来自其亲代细胞的膜蛋白、胞质组分和生物活性分子（如DNA/RNA、细胞因子），使其在细胞间通讯、伤口愈合、组织再生和免疫调节中发挥有效的旁分泌作用。
鉴于牙龈成纤维细胞（Gingival Fibroblasts, GFs）作为在种植体植入后调节局部组织反应、影响结缔组织行为并参与种植体界面处细胞外基质重塑的关键细胞群，其来源的细胞外囊泡可能含有来自亲代细胞的关键生物活性分子，从而发挥类似的调节作用。本研究假设，通过被动吸附负载功能化了人牙龈成纤维细胞来源微囊泡（hGFs-MVs）的TNP表面，将增强早期愈合过程中的成纤维细胞粘附和胶原成熟，从而在维持有利于骨整合的条件的同时，促进稳定的软组织界面。
2 材料与方法
2.1 实验设计
从人原代牙龈成纤维细胞（hGFs）中通过16,000 g离心分离微囊泡（hGFs-MVs），随后通过被动吸附负载到具有纳米孔（TNP）的纳米工程钛种植体表面。拔除大鼠上颌第一磨牙，经过4周愈合期后，将TNP单独或负载hGFs-MVs的TNP种植体植入拔牙窝。在植入后1周和4周收集样本，进行微计算机断层扫描（micro-CT）和树脂切片组织学分析。
2.2 通过电化学阳极氧化在钛种植体上制备TNPs
使用由IV级商业纯钛定制的适度粗糙的钛种植体（直径2 mm，长度3 mm）。在阳极氧化之前，钛种植体在乙醇中彻底超声清洗并风干。使用含5%水（v/v）和0.3%氟化铵（NH4F）的适当老化乙二醇电解质。钛种植体（阳极）和非目标钛种植体（阴极）浸入电解质中，在80 V电压下阳极氧化60分钟以制备纳米孔（TNPs）。
2.3 hGFs-MVs的富集与表征
从一名37岁女性捐赠者的第三磨牙拔除后的富余牙周组织中分离人原代牙龈成纤维细胞（hGFs）。在90%融合度时，hGFs用杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水（DPBS）冲洗，并在无血清杜尔贝科改良 Eagle 培养基（DMEM）中培养16小时以收集条件培养基（CM），随后进行MV分离。采用差速离心法分离hGFs-MVs：收集的条件培养基（~150 mL）依次在300 g和2,600 g（各15分钟，4°C）离心去除碎片和凋亡小体，随后在16,000 g下离心20分钟以沉淀微囊泡（MVs）。
富集的hGFS-MVs按照最新的国际细胞外囊泡研究指南进行表征。通过透射电子显微镜（TEM）和冷冻电子显微镜（cryo-EM）检查形态，通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）评估尺寸分布，通过BCA测定法测量蛋白质含量，并使用多重外泌体检测试剂盒分析EV表面标志物。
2.4 EV负载至TNP种植体及EV释放曲线
hGFs-MVs通过被动吸附在室温下负载到TNP种植体上。基于先前证明能有效调节体外炎症反应的研究，每个TNP种植体负载1 × 109个MVs，用于体外MV释放测定和体内植入实验。通过原子力显微镜（AFM）测量评估MV负载后的表面粗糙度参数。使用DiO标记的hGFs-MVs并通过共聚焦显微镜确认成功负载。
通过将种植体在37°C的PBS中孵育，并在第1、3、7天收集和更换PBS，评估MV从TNP种植体的释放。使用BCA蛋白测定法和CD9 ELISA对释放的MVs进行定量。
2.5 体内种植体手术程序
使用24只8周龄Wistar大鼠（雄:雌=1:1）。将大鼠随机分为两个实验组：TNP组（n=6）和hGFs-MV/TNP组（n=6），在植入后两个时间点（1周和4周）进行评估。拔除大鼠双侧上颌第一磨牙。经过4周愈合期后，将TNP和hGFs-MVs/TNP种植体植入近中拔牙窝。种植体植入扭矩约为15 N·cm。
2.6 骨结合的MicroCT分析
在植入后1周和4周，处死动物并小心采集包含种植体的上颌标本块。使用Skyscan 1272进行Micro-CT成像。将感兴趣区域（ROI）定义为从种植体螺纹向外延伸0.15 mm的区域。在该ROI内，计算骨体积百分比（%ROI）以评估新骨形成。骨密度使用灰度强度值评估。测量骨表面积（mm2）以量化骨-种植体界面，并计算表面积与体积比以评估种植体周围新形成骨的结构复杂性和质量。
2.7 骨结合和种植体周围软组织形成的组织学和组织形态计量学分析
上颌样本经过梯度乙醇系列脱水，并用树脂混合物（甲基丙烯酸甲酯/乙二醇甲基丙烯酸酯）渗透进行硬组织包埋。制备沿种植体长轴、平行于颊腭方向的纵向切片（最终厚度20 μm），使用Golden trichrome和H&E染色。使用QuPath软件由单盲训练的检查员进行组织形态计量学分析。
骨结合使用两个主要参数评估：骨-种植体接触率（BIC %）和骨面积百分比，测量均排除种植体螺纹。BIC %通过计算骨接触区域（黄线标记）长度与总种植体长度（白线表示）的百分比比率来确定。骨面积百分比测量为种植体区域内（绿色圈出）骨面积与总种植体面积（紫色圈出）的比率。
对于种植体冠方三分之一（排除螺纹）的种植体周围软组织，评估包括软组织细胞-种植体接触百分比（计算为软组织附着长度与总种植体长度的比率，反映软组织对种植体表面的粘附程度）和成熟胶原纤维百分比（通过比较种植体表面附近成熟胶原纤维长度与总种植体长度来评估）。此外，通过计算每个螺距内的结缔组织细胞数量（排除有上皮长入的螺距和螺纹）来评估细胞密度。
2.8 统计分析
数据以平均值±标准差（SD）表示。使用Shapiro-Wilk检验评估数据正态性。两组（TNP vs. hGFs-MVs/TNP）之间的比较使用Mann-Whitney U检验（非配对，双尾）进行。p值<0.05被认为具有统计学显著性。
3 结果
3.1 hGFs-MVs的EV表征
具有代表性的cryo-EM和TEM图像显示了圆形EV形态，在cryo-EM下显示出特征性的双层脂质双分子层。CD9 ELISA证实了hGFs-MVs上存在EV表面标志物CD9。纳米颗粒跟踪分析显示EV颗粒尺寸范围在90至600 nm之间，在约89、128、200、275和460 nm处观察到几个峰值。模式和平均颗粒尺寸均低于200 nm，总EV蛋白质含量约为80 μg。EV浓度测量为7 × 109颗粒/mL，纯度为6 × 107颗粒/μg蛋白质。所有常见的EV表面标志物——CD9、CD63和CD81均被检测到，其中CD63表达较高。此外，CD49e、MCSP、CD44和CD29也有表达，每个的MFI值均高于10,000。
3.2 EV从hGFs-MVs/TNP种植体的释放
TNP种植体的SEM图像显示电化学阳极氧化后形成了纳米多孔表面结构（孔径45.8 ± 19.8 nm）。DiO标记的hGFs-MVs（DiO-hGFs-MVs）的三个代表性图像显示了囊泡的球形形态。使用3D最大强度投影可视化了EV表面负载的证据，显示绿色的圆形DiO-hGFs-MVs从顶部和侧面视图附着在TNP种植体表面。BCA测定表明EV释放在第3天达到峰值，显著高于第0天和第7天的水平。CD9 ELISA进一步支持了这些发现，证实了释放的EVs的存在。AFM粗糙度结果显示，两组之间的表面粗糙度无显著差异，TNP种植体的Ra = 42.7 ± 15.9 nm，Rq = 51.3 ± 18.8 nm，而hGFs-MVs-TNP样品的Ra = 42.5 ± 16.6 nm，Rq = 52.1 ± 18.9 nm。
3.3 骨-种植体骨结合的MicroCT和组织学分析
使用ROI设定在种植体周围0.15 mm的microCT图像对骨-种植体骨结合进行量化。TNP和hGFs-MVs/TNP种植体在植入后1周和4周的代表性重建microCT图像显示，两组在ROI内的骨百分比、骨密度（灰度值）、骨表面积（mm2）和表面积与体积比方面，在两个时间点均无显著差异，总感兴趣体积（VOI）一致约为1.5 mm3。
H&E和Golden trichrome染色的组织学图像显示种植体螺纹位于骨水平以下。在第1周可见类骨质形成，而在第4周观察到成熟的矿化骨。骨面积（%）的量化显示hGFs-MVs/TNP组在所有时间点百分比略高；然而，在植入后1周和4周均无显著差异。关于BIC%，在植入后1周初期，组间无差异。然而，在第4周，hGFs-MVs/TNP组显示出显著高于TNP组的BIC%。
3.4 种植体周围软组织形成分析
使用H&E和Golden trichrome染色的组织学图像评估种植体周围软组织整合，图像显示种植体螺纹位于骨水平以上。两种种植体在结缔组织细胞-种植体接触百分比方面没有差异。在植入后4周，与自身在植入后1周的水平以及同期TNP组相比，hGFs-MVs/TNP种植体表现出显著更高的结缔组织细胞对种植体表面的附着，表明hGFs-MVs处理随时间增强了结缔组织细胞粘附。此外，代表更先进种植体周围软组织重塑的更厚、更有序的成熟胶原纤维百分比，在两组中均从第1周到第4周显著增加，与正常愈合一致。值得注意的是，hGFs-MVs/TNP种植体在第4周显示出显著高于TNP组的成熟胶原纤维水平，表明hGF-MVs可能加速种植体周围软组织重塑并增强胶原成熟。
4 讨论
近年来种植体表面工程的进展表明，将TNP种植体与EVs（如外泌体）结合在增强骨结合方面具有显著潜力。越来越多的体外和体内研究调查了纳米工程Ti表面与来自MSCs或巨噬细胞的EVs的协同效应，显示能增强成骨分化、矿化和调节免疫反应。虽然这些研究的焦点集中在骨结合结局上，但种植体周围软组织愈合同样关键的作用对于长期种植体稳定性、感染预防和种植体-组织界面功能恢复也必须得到承认。本研究通过功能化TNP种植体表面与hGFs-MVs来评估其在体内对软硬组织整合的影响，从而解决了这一空白。
在植入后4周，hGFs-MV/TNP组显示出显著更高的骨-种植体接触率（BIC%）、增加的软组织细胞附着以及更大比例的成熟胶原纤维，与仅TNP组相比。这些结果凸显了hGFs-MVs在增强骨形成和软组织密封完整性方面的双重作用，这对于长期种植体稳定性和功能至关重要。
细胞分泌多种EVs亚型，尺寸范围从30到1000 nm，包括外泌体、MVs和凋亡小体，每种都有不同的起源和功能。然而，EV亚型之间重叠的尺寸和共享的EV表面标志物（CD9、CD81和CD63）对富集和下游功能测定提出了挑战。MVs通常通过质膜出芽形成，并在低速离心（<300 g）去除细胞和碎片后，使用低于20,000 g的差速离心进行富集。本研究中，hGFs来源的MVs在16,000 g下分离，产生90-600 nm的囊泡，模式尺寸约为130 nm。
最近的体内研究表明，纳米工程钛种植体表面单独使用或与来自不同细胞来源的外泌体结合，通过调节骨祖细胞和免疫细胞行为来增强骨结合。与先前关于外泌体和微囊泡负载的TiO2纳米管/纳米孔系统的报告一致，MV负载后TNP种植体的表面粗糙度保持不变。例如，阳极氧化处理的TNTs增强了BMSC-外泌体分泌和胫骨骨-种植体接触，同时通过整合素β1/FAK/MAPK通路促进成骨并抑制破骨生成。与这些报告一致，我们的研究表明植入hGFs-MVs修饰的钛表面后，骨-种植体接触和种植体周围骨形成显著增加，支持了促成骨效应。
软组织附着在长期维持种植体周围健康以及最终减少生物并发症方面的作用不容小觑。种植体周围软组织密封的质量对于在种植体-黏膜界面周围建立稳定且抗感染的防线、最小化细菌入侵、减少炎症和提高长期种植体成功率至关重要。我们的数据显示，hGFs-MVs/TNP不仅增强了骨-种植体整合，还通过增加软组织细胞附着和促进成熟胶原纤维取向来改善软组织愈合，这些是促进穿黏膜种植体颈圈周围软组织密封的重要特征。
尽管如此，必须考虑不同研究间EV负载量和细胞来源的显著差异。本研究每个2 mm TNP种植体使用109个hGFs-MVs，在室温下负载1小时。而其他研究使用了不同的负载方案和剂量。此外，来自不同细胞来源的外泌体可能含有不同的组成，对EV货物贡献各异。使用细胞外囊泡相较于基于细胞的疗法的一个优势是它们的低免疫原性，即使在跨物种（异种）背景下也是如此。
本研究侧重于短暂的4周体内早期愈合期，可能无法完全捕捉晚期软组织成熟、骨重塑变化和长期种植体稳定性。树脂包埋的硬组织切片阻碍了直接评估免疫化学、免疫细胞浸润、细胞因子表达或hGFs-MVs效应的分子机制。无法从这些初步概念验证结果中得出结论关于软组织密封对完全功能性牙科修复体的完整性。此外，未评估其他细胞来源的EVs，观察到的改善是否特异于hGFs-MVs尚不清楚。未来的研究应侧重于理解长期组织稳定性、功能结局，并纳入替代EV来源以阐明临床相关功能下的细胞特异性效应。
5 结论
这项“概念验证”体内研究表明，hGFs-MVs与TNPs结合可显著改善口腔内钛种植体周围的骨和软组织整合。通过同步增强骨结合和软组织愈合，这种双重方法为改善种植体治疗成功率提供了有前景的潜力。需要进一步的研究来确认种植体周围组织随时间的长期稳定性，并阐明潜在的生物学机制。
