《Advanced Healthcare Materials》：Interfacial Bioengineering of Dynamic Networks Hybrid Hydrogel for Programmed Intervention in Oral Precancerous Epithelial States
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本研究开创性地提出了一种界面生物工程策略，构建了兼具贻贝强力湿粘附与巨噬细胞免疫靶向功能的双仿生杂化水凝胶MSA@PGel。该材料通过动态儿茶酚-Fe3+配位键形成坚固网络，突破口腔黏膜递送屏障，实现长达3小时的病灶滞留。其程序化干预机制通过靶向HIF-1α代谢调节器，协同增强光动力疗法（PDT）并触发凋亡级联，在口腔白斑（OLK）大鼠模型中显著诱导组织学正常化。这项工作为上皮癌前状态的程序化管理建立了新范式。
1 引言
阻止癌前病变向侵袭性癌症发展是公共卫生优先事项。当前口腔白斑（OLK）的治疗面临挑战，氨基乙酰丙酸介导的光动力疗法（ALA-PDT）的疗效受限于病变固有的缺氧特性。丹酚酸B（SAB）可改善组织氧合并增强ALA-PDT疗效，但其应用受限于组织穿透性差、清除快、靶向性弱及湿润口腔环境下粘附力弱等问题。受贻贝粘附启发，多巴胺（DA）基水凝胶能在湿润口腔黏膜上提供强粘合和延长药物滞留。本研究报道了一种程序化杂化水凝胶MSA@PGel的设计与应用，它集成了仿生靶向和生物粘附黏膜滞留功能，用于程序化干预上皮癌前状态。
2 结果
2.1 MSA脂质体的合成与表征
SAB和5-ALA共载脂质体（SA）通过既定方案合成。组织病理学评估显示，与邻近正常组织相比，OLK和口腔鳞状细胞癌（OSCC）病变中存在显著的M2巨噬细胞浸润和VCAM-1过表达。通过共挤压法将M2巨噬细胞膜囊泡包被到SA脂质体上，生成膜功能化的MSA脂质体。透射电子显微镜（TEM）显示SA颗粒呈均匀球形结构（26.67 ± 0.67 nm），而MSA颗粒显示具有可见膜包被的核壳结构（118.67 ± 1.34 nm）。动态光散射（DLS）进一步证实了成功的膜包被。蛋白质分析和紫外-可见光谱扫描证明了膜蛋白的保留以及MSA颗粒对5-ALA和SAB的高包封效率。
2.2 MSA@PGel和PGel的表征
为应对湿润环境下的口腔黏膜药物递送挑战，设计了一种具有固有水下粘附能力的渗透性贻贝仿生水凝胶平台PGel。该pH响应性互穿网络（IPN）作为基本基质，通过表面分散吸附冻干MSA颗粒，形成MSA负载复合材料MSA@PGel。MSA@PGel实现了可编程的脂质体释放。两种水凝胶在生理相关条件下均表现出快速凝胶。扫描电子显微镜（SEM）显示PGel具有大孔结构，MSA颗粒被截留在这些孔内。表面润湿性分析证实两者均具有亲水性。此外，水凝胶表现出优异的自愈能力。流变学表征显示MSA@PGel具有增强的粘弹性鲁棒性。MSA@PGel的机械增强网络直接转化为优异的粘附和拉伸机械性能。在PBS中超过24小时的长期pH稳定性得到确认。
2.3 病灶靶向MSA@PGel的功能分析
从储存条件（pH 5.4）到生理口腔pH（7.4）的转变触发了MSA颗粒从MSA@PGel中的释放，使得MSA颗粒能够通过M2巨噬细胞膜衍生的表面标志物主动靶向OLK病变内的VCAM-1+上皮细胞。结构验证通过免疫荧光（IF）证实了VCAM-1在Leuk-1细胞膜上的过表达，而细胞摄取测定显示，仅2小时后MSA颗粒的内化显著增强，证实膜功能化对于受体介导的靶向至关重要。这种时空控制与持续的黏膜滞留协同作用。体内荧光成像揭示了截然不同的药代动力学特征。严格的生物安全性评估证实了其转化可行性。
2.4 MSA@PGel-PDT增强凋亡中HIF-1α靶向的机制层次
利用MSA@PGel的靶向递送和滞留优势，评估了其在使用Leuk-1细胞的OLK恶性转化过程中的PDT疗效。MSA@PGel-PDT在24小时将细胞活力降低至30.9 ± 3.12%，显著低于5-ALA-PDT。通过流式细胞术对凋亡动力学的功能验证显示，MSA@PGel-PDT产生了显著更高的晚期凋亡群体。为揭示疗效的分子驱动因素，利用单细胞转录组学（scRNA-seq）数据集，并鉴定出HIF1A在OLK向OSCC进展过程中差异上调。非整倍体细胞主导病变并过表达HIF1A。人OLK组织中HIF-1α水平升高确立了其治疗相关性。分子对接证实了SAB与HIF-1α之间的高亲和力结合。实验上，MSA@PGel预处理抑制了核HIF-1α易位和PDT后表达，同时伴随caspase-3激活。机制分析进一步揭示MSA@PGel-PDT在激光照射前触发了活性氧（ROS）爆发和线粒体膜电位（ΔΨm）去极化，启动了线粒体凋亡。
2.5 MSA@PGel-PDT中线粒体凋亡启动克服缺氧耐受
为解析克服缺氧的机制，对MSA@PGel-PDT处理的Leuk-1细胞进行RNA测序（RNA-seq）分析，揭示了两种互补的转录反应。与激光照射的缺氧对照相比，MSA@PGel-PDT显著抑制了氧化磷酸化途径。基因集富集分析（GSEA）证实了显著下调。关键的是，相对于5-ALA-PDT，MSA@PGel-PDT选择性激活了NF-κB通路和泛素-蛋白酶体系统。机制上，MSA@PGel颗粒通过整合素α4β1与Leuk-1细胞上的VCAM-1结合并发生内化。内化后，释放的MSA结构解离出SAB以螯合HIF-1α，阻断核易位并逆转肿瘤缺氧。这种缺氧缓解使得5-ALA衍生的ROS爆发能够使ΔΨm去极化并激活caspase-3，同时触发转录因子驱动的线粒体崩溃和蛋白毒性应激，通过协同的蛋白毒性和代谢灾难瓦解缺氧驱动的耐药性。
2.6 MSA@PGel-PDT在4-NQO诱导的OLK大鼠模型中的体内疗效
在4-NQO诱导的OLK模型中评估了MSA@PGel-PDT的疗效。在4周时的宏观评估显示，与对照组相比，MSA@PGel-PDT组的口腔白斑斑块显著消退。舌背上皮的H&E染色表明，MSA@PGel-PDT组的上皮异型增生显著减少。Ki67免疫组化（IHC）图像证实，与5-ALA-PDT和对照组相比，MSA@PGel-PDT组治疗上皮层内的增殖活性大幅降低。为阐明MSA@PGel-PDT疗效的潜在机制，在PDT后3小时使用二氢乙锭（DHE）染色评估病变组织中的ROS水平。通过ELISA对舌背组织的进一步分子分析显示，MSA@PGel-PDT显著上调了促炎细胞因子TNF-α，同时下调了免疫抑制细胞因子TGF-β1。蛋白质印迹（WB）分析表明，MSA@PGel-PDT有效降低了缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的水平，并显著提高了cleaved caspase-3的表达。全面的生物安全性评估显示对器官组织病理学、血液学、血清生化、体重或存活率没有不良影响。
3 讨论
尽管本研究使用的4-NQO诱导大鼠模型为研究口腔癌前病变的治疗效果提供了一个成熟的平台，但需承认其在完全反映人OLK异质性方面的局限性。MSA@PGel卓越的机械性能（包括其强大的粘附性、高强度和显著的拉伸性）机制上源于其独特的仿生设计，该设计利用了动态儿茶酚-Fe3+配位键。这项研究开创了一个仿生治疗范式，通过整合病理驱动的仿生靶向与突破性黏膜粘附水凝胶技术，从根本上重新设计了阻止OLK恶性转化过程的管理策略。除了递送创新，这项工作将HIF-1α确立为驱动OLK恶性转化过程的主要代谢调节器。MSA@PGel平台通过建立三种新范式，意义显著超越OLK管理。MSA@PGel的持续黏膜滞留（>3小时）支持了实用的治疗窗口。
4 结论
成功构建了一个双仿生网络系统，集成了强大的黏膜粘附性和精确的细胞靶向性。这个界面生物工程平台通过破坏OLK中缺氧驱动的恶性转化过程，为程序化干预提供了一个强大工具。这项工作不仅为OLK提出了一种高效的治疗策略，而且为设计动态生物材料网络以解决肿瘤学中的复杂挑战建立了新范式。
5 实验部分
（此部分详细描述了材料合成、表征、体外和体内实验方法，包括动物模型、细胞培养、粒子制备、各种物理化学性质测试、生物学功能评估、组学分析及统计方法等具体实验流程和参数。）
