《Journal of Biological Chemistry》：Chronological lifespan extension and nucleotide salvage inhibition in yeast by isonicotinamide supplementation
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本研究针对异烟酰胺（INAM）延长酵母时序寿命（CLS）的机制尚不明确的问题，通过化学基因组学筛选、代谢组学分析和酶学实验，揭示了INAM通过部分抑制核苷酸酶（如Phm8、Sdt1）和碱性磷酸酶（Pho8）活性，适度限制核苷酸库，从而诱导有益的 hormesis 应激反应，进而延长酵母时序寿命。该发现为理解代谢干预延缓衰老提供了新视角。
衰老是一个导致细胞或机体功能随时间推移而下降，并最终走向死亡的多因素过程。尽管不同生物的寿命存在巨大差异，但许多参与衰老的蛋白质和通路在进化上是保守的。以出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）为代表的模式生物，在识别和表征关键长寿因子方面发挥了重要作用，例如NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶Sir2。Sir2通过稳定rDNA重复序列，对维持酵母母细胞的复制寿命（RLS）至关重要。然而，在非增殖细胞的稳定期（即时序寿命，CLS）中，Sir2却通过特异性去乙酰化（从而失活）糖异生限速酶Pck1，限制了细胞的长期存活。糖异生能提高乙醇和乙酸盐的利用率，增加糖原/海藻糖的储存，从而增强应激抵抗力和CLS。
Sir2的同源物异烟酰胺（INAM）是NAD+前体烟酰胺（NAM）的异构体，它能刺激Sir2的酶活性。将INAM加入培养基可通过维持细胞内NAD+稳态来促进这种单细胞生物的RLS。INAM也能延长酵母的CLS，但其潜在机制在很大程度上仍不清楚。有趣的是，尽管INAM在体外能刺激重组Sir2的组蛋白去乙酰化（HDAC）活性，但其在体内促进Sir2依赖性转录沉默和RLS的作用，是在NAD+前体（NAM或烟酸）受限时通过维持细胞内NAD+稳态实现的。INAM并非直接的NAD+前体，因此其对NAD+稳态的影响可能涉及对从头合成或补救途径中一个或多个步骤的调节。
为了阐明INAM延长CLS的机制，研究人员开展了一项研究。他们首先证实INAM诱导的CLS延长具有浓度依赖性，且不依赖于酵母菌株的营养缺陷型或五种sirtuin蛋白（Sir2, Hst1, Hst2, Hst3, Hst4），表明其作用机制不同于NAM，并可能存在新颖的CLS调控机制。
为了识别可能受INAM影响的细胞通路，研究人员对酵母基因敲除（YKO）集合中的突变体进行了化学基因组学筛选，以寻找对INAM生长抑制敏感的突变株。对候选基因的显著基因本体（GO）术语分析包括转录延伸因子、汇聚于一碳代谢的代谢通路以及从头嘌呤合成，这些结果共同提示INAM干扰了核苷酸代谢。的确，代谢组学分析发现，INAM会引起细胞内胞苷、尿苷和鸟苷（这些核糖核苷来源于核苷单磷酸[NMP]通过核苷酸酶[Phm8, Sdt1, Isn1]或碱性磷酸酶Pho8的分解）的浓度依赖性耗竭。研究人员还发现，INAM直接抑制以胞苷或烟酰胺单核苷酸（NMN）为底物的重组核苷酸酶活性，并抑制从全细胞提取物中定量到的碱性磷酸酶活性。最后，他们发现Phm8和Pho8是INAM诱导的CLS延长所特异性需要的，这提示它们可能是INAM在体内的功能靶点。
研究人员进一步将INAM与霉酚酸（MPA，一种IMPDH抑制剂，可耗竭鸟嘌呤核苷酸库）进行了比较。发现INAM与MPA在抑制生长方面存在强烈的协同效应，但INAM的CLS延长效应不能被鸟嘌呤逆转，表明INAM并非直接抑制IMPDH。深入的酶学实验证实，INAM能直接抑制重组Sdt1和Phm8核苷酸酶对CMP和NMN的水解活性，而NAM在相同浓度下反而刺激Sdt1的活性，这揭示了INAM与NAM功能上的重要区别。对碱性磷酸酶活性的测定也表明INAM能中度抑制Pho8和Pho13的活性。
最关键的是，研究发现INAM无法延长 pho8Δ phm8Δ双突变体的CLS，这表明Pho8和Phm8是介导INAM诱导CLS延伸的功能相关靶点。基于这些发现，研究人员提出了一个模型：INAM通过部分抑制核苷酸酶（如Phm8, Sdt1）和碱性磷酸酶（Pho8）的活性，适度损害核苷酸和/或NAD+的补救途径，这种适度的压力触发了一种有益的hormesis应激反应，从而在时序衰老过程中支持增强的静息状态，最终延长CLS。
本研究主要应用了以下关键技术方法：利用酵母基因敲除（YKO）集合进行化学基因组学筛选以识别INAM敏感突变体；通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行靶向代谢组学分析，定量细胞内核苷酸、核苷、碱基及NAD+相关代谢物的水平；采用体外酶活试验分析INAM对重组核苷酸酶（Sdt1, Phm8）活性的直接影响；使用96孔板进行剂量反应生长曲线分析以评估化合物间的协同效应；通过时序寿命（CLS）测定评估INAM及基因突变对酵母存活期的影响。
INAM诱导的CLS延长具有浓度依赖性且不依赖于营养缺陷型
研究人员首先在YKO亲本菌株BY4741中测试了INAM的剂量效应。结果显示，浓度在10至25 mM时，INAM对CLS的延长效果达到平台期，而50 mM的INAM尽管在第3天导致存活率降低，但仍能延长CLS。为了排除BY4741中营养缺陷型突变对CLS延长的潜在影响，他们发现在原养型 progenitor 菌株FY4中，25 mM的INAM同样能延长CLS。此外，在细胞进入稳定期后（接种后96小时）添加25 mM的INAM，仍然能够延长BY4741的CLS，尽管效果不如在接种时添加那样显著。这表明INAM的作用机制可能同时影响增殖期和静息期的细胞。
INAM延长CLS不依赖于Sirtuins
尽管INAM补充能抑制酵母细胞进入稳定期时通常发生的NAD+耗竭，并且与 elevated NAD+能增强SIR2功能相关，但INAM诱导的CLS延长并不需要SIR2。考虑到Sir2与其旁系同源蛋白Hst1等功能存在冗余，研究人员测试了INAM对缺失所有5个sirtuin基因（SIR2, HST1, HST2, HST3, HST4）的突变体CLS的影响。虽然该五重sirtuin突变体的CLS相较于对照有所缩短，但10 mM的INAM仍能显著延长其寿命，这表明sirtuins并非INAM发挥益寿作用所必需的。
化学基因组筛选鉴定INAM敏感缺失株
为了识别能够缓冲INAM所损害细胞过程的基因，研究人员将MATa单倍体YKO菌株集合点种在含有0, 25, 50, 75或125 mM INAM的合成完全（SC）矩形琼脂平板上。通过比较INAM平板与SC对照平板上每个突变体菌落的生长情况，并设定严格的阈值，他们鉴定出对INAM敏感的突变体。GO富集分析显示，这些敏感突变体显著富集在转录调控、自噬、液泡运输、肌醇磷酸生物合成和染色质重塑等相关的生物学过程术语中。细胞组分术语则覆盖了INO80和SWR1染色质重塑复合物、转录延伸因子、内吞体和ESCRT复合物等。对61个重新测试的缺失突变体的确认实验表明，其中57个对INAM敏感，证明了筛选结果的可靠性。
INAM干扰核苷酸代谢
对INAM敏感突变体的分析提示INAM可能干扰核苷酸代谢。代谢组学分析证实，INAM处理能引起对数生长期细胞中胞苷、鸟苷和尿苷等核苷的显著减少。随着细胞进入稳定期，核苷三磷酸（NTP）和脱氧核苷三磷酸（dNTP）的整体水平也出现显著下降。这些变化伴随着参与嘌呤和嘧啶环从头合成的天冬氨酸和谷氨酰胺的减少。值得注意的是，UTP水平在处理96小时后并未显著降低，且尿嘧啶、尿苷、UMP和UDP在96小时时均显著上调，这可能与BY4741菌株的ura3Δ0突变阻断UMP的从头合成，迫使细胞从培养基中补救尿嘧啶有关。
INAM抑制核苷酸酶和碱性磷酸酶活性
研究发现，INAM能直接抑制重组Sdt1和Phm8核苷酸酶以CMP或NMN为底物的活性。相反，NAM在相同浓度下反而刺激Sdt1的核苷酸酶活性，这清晰地揭示了INAM与NAM在功能上的区别。此外，INAM还能中度抑制从野生型、pho8Δ、pho13Δ菌株全细胞提取物中测得的碱性磷酸酶（以pNPP为底物）活性。这些结果表明，INAM通过抑制核苷酸酶和碱性磷酸酶的活性，影响了核苷酸的补救途径。
Pho8和Phm8是INAM诱导CLS延伸所必需的
最关键的功能验证表明，INAM无法延长 pho8Δ phm8Δ双突变体的CLS，而单独缺失 phm8、sdt1、isn1或 pho8基因，INAM仍能延长其CLS（尽管 pho8Δ突变体本身的CLS缩短）。这一结果将Pho8和Phm8锁定为介导INAM诱导CLS延伸的功能相关体内靶点。
讨论与意义
本研究揭示了INAM延长酵母时序寿命的一种新机制：通过抑制核苷酸酶（如Phm8, Sdt1）和碱性磷酸酶（Pho8）的活性，部分损害核苷酸和/或NAD+的补救途径，从而诱导一种有益的 hormesis 应激反应。这种适度的核苷酸库限制可能模拟了轻微的复制压力，促进细胞更有效地进入静息状态，从而在时序衰老中获得生存优势。该机制独立于sirtuins，并且与NAM的作用机制有显著区别（如INAM不产生突变效应）。
这项研究不仅深化了对代谢物干预衰老机制的理解，而且鉴定出的关键靶点（如Pho8, Phm8）为探索衰老干预新靶点提供了线索。INAM作为已知的药物合成骨架，其延寿机制的揭示也为相关药物的潜在健康span效应提供了新的视角。研究结果强调了对核苷酸代谢进行适度调控在衰老干预中的重要性，论文已发表在《Journal of Biological Chemistry》上。
