《Journal of Biological Chemistry》：Matriptase-2-mediated suppression of hepatic hepcidin expression in mice requires hepatocyte neogenin
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本研究针对铁代谢调控关键激素铁调素（hepcidin）的表达调控机制，揭示了膜蛋白酶-2（MT2）抑制铁调素表达依赖于肝细胞Neogenin（NEO1）的新机制。研究人员通过构建基因敲除小鼠模型并结合细胞实验发现，MT2并非通过其蛋白酶活性切割NEO1，而是通过稳定NEO1并与之相互作用，从而抑制由骨形态发生蛋白（BMP）信号通路介导的铁调素表达。该研究阐明了铁稳态调控网络中的一个关键环节，为理解遗传性血色素沉着症和铁难治性缺铁性贫血等疾病的发病机制提供了新视角。
铁是生命体不可或缺的微量元素，然而，体内铁过多或过少都会对健康造成严重危害。由于人体缺乏有效的排铁机制，全身铁稳态的维持依赖于对十二指肠铁吸收、巨噬细胞中铁回收以及肝脏储存铁动员的精密协同调控。在这一过程中，铁调素（Hepcidin）作为一种关键的铁调节激素，发挥着核心作用。这种主要由肝细胞分泌的25个氨基酸肽，通过阻断唯一已知的铁输出蛋白——膜铁转运蛋白（ferroportin）的功能，来控制铁从十二指肠上皮细胞、巨噬细胞和肝细胞进入循环的过程。铁调素表达失调会导致严重的疾病：铁调素缺乏会引起青少年血色素沉着症，一种严重的铁过载疾病；而不适当的高水平铁调素则会导致铁难治性缺铁性贫血（IRIDA）。在生理条件下，系统铁稳态是通过肝脏中铁调素表达的严格调控来实现的。
肝脏铁调素的表达主要通过BMP信号通路诱导。该通路利用一组特定的BMP配体（如BMP2、BMP5、BMP6）、BMP受体（如ALK2、ALK3、ActRIIA、BMPR2）和胞内SMAD蛋白（SMAD1/5/8）来激活铁调素基因的转录。此外，正常的铁调素表达范围还需要其他膜蛋白的参与，包括Neogenin（NEO1）、血幼素（HJV，又称HFE2）、血色素沉着症蛋白（HFE）和转铁蛋白受体2（TFR2）。在小鼠中，肝细胞特异性敲除Neo1或Hjv基因会降低铁调素表达并导致铁过载。类似地，破坏Neo1与Hjv的相互作用也会产生相同效应。
与HJV类似，NEO1也能与膜蛋白酶-2（Matriptase-2, MT2）相互作用。MT2是铁调素表达的一个关键负调控因子，由人类TMPRSS6基因和小鼠Tmprss6基因编码。MT2突变会导致人体内铁调素不适当升高，引起IRIDA。在培养的细胞系中，MT2被证明可以切割铁调素诱导通路中的多个组分，包括HJV，从而抑制BMP信号通路。然而，在体研究却提示MT2可能通过非蛋白酶活性的机制，例如通过与结合伴侣结合来阻断其功能，从而下调铁调素。MT2与NEO1和HJV均存在相互作用，但其在体内抑制铁调素的具体分子机制，特别是与NEO1的关系，尚不完全清楚。
为了探究NEO1与MT2相互作用在铁调素表达中的作用，研究人员开展了一系列实验。本研究测试了“肝细胞NEO1是MT2抑制铁调素表达所必需的”这一假说。研究人员使用了小鼠和肝癌细胞系作为模型。
在技术方法上，本研究主要运用了基因工程小鼠模型（包括肝细胞特异性Neo1敲除、Tmprss6全身性敲除及双敲除小鼠）、腺相关病毒血清型8（AAV8）介导的基因在肝脏中的过表达、针对不同铁负荷（缺铁、正常铁、高铁饮食）的体内干预、实时定量PCR（qRT-PCR）检测基因转录水平、蛋白质印迹（Western Blot）分析蛋白表达与定位、血清和肝脏非血红素铁含量测定、血清铁调素检测以及细胞表面生物素化等关键技术。
研究结果首先显示，在Hep3B细胞中共同表达带FLAG/MYC标签的小鼠Mt2（fMt2）和Neo1（fNeo1）时，fMt2能显著降低全细胞提取物和细胞表面的fNeo1水平，并且这种降低可被丝氨酸蛋白酶抑制剂抑肽酶完全阻断。这表明在细胞模型中，Mt2能够通过其蛋白酶活性切割Neo1。
然而，在体研究得到了不同的结果。与野生型小鼠相比，八周龄Tmprss6-/-小鼠的肝脏Neo1蛋白水平并未因Mt2的缺失而增加，反而出现了适度的降低。通过AAV8病毒载体在Tmprss6-/-小鼠肝脏中重新表达外源性fMt2，可以剂量依赖性地提高肝脏Neo1蛋白水平，并纠正Tmprss6缺失导致的高铁调素和低血清铁表型。相反，表达缺乏蛋白酶结构域的失活型fMt2mask对Neo1水平的提升作用很微弱。这些结果说明，在体内环境中，Mt2并非通过切割降解Neo1，反而是起到了稳定Neo1蛋白的作用。
为了明确Mt2抑制铁调素是否依赖于其与Neo1的相互作用，研究人员构建了肝细胞特异性Neo1敲除与Tmprss6全身性敲除的双突变小鼠（Neo1-/-;Tmprss6-/-）。研究发现，同时缺失Neo1和Tmprss6完全消除了仅缺失Tmprss6所观察到的铁调素异常升高和缺铁性贫血表型。相反，Neo1-/-;Tmprss6-/-双突变小鼠表现出与Neo1-/-单突变小鼠相似程度的铁调素降低和铁过载。这表明，Mt2调控铁稳态的功能依赖于肝细胞中Neo1的存在。
进一步通过给小鼠喂食不同铁含量的饲料，研究铁负荷对肝细胞Neo1的影响以及Neo1在铁诱导铁调素表达中的作用。结果显示，在野生型小鼠中，增加机体铁负荷会适度降低肝脏Neo1蛋白水平，但不影响其mRNA水平，提示高铁负荷可能促进了Neo1的降解。在缺乏肝细胞Neo1的小鼠中，增加饮食铁含量依然能够诱导铁调素及其下游信号分子Id1的表达，但其诱导程度相对于肝脏铁浓度而言，显著低于野生型小鼠。这表明Neo1缺失削弱了，但并未完全废除铁对铁调素的诱导能力。值得注意的是，在Neo1-/-背景下再敲除Tmprss6，小鼠仍能对铁负荷产生反应，适度上调铁调素，但其上调幅度远小于Tmprss6单敲除小鼠。这说明，在缺乏Neo1的情况下，Mt2仍然具有一定的抑制铁调素的能力，但作用有限，暗示肝细胞Neo1是Mt2的主要作用靶点，但并非唯一靶点。
对BMP信号通路关键组分的研究发现，双敲除小鼠肝脏中Hjv、Alk2、Alk3、Hfe、Tfr2和Bmp6的mRNA水平均无显著变化。而肝脏Tfr2蛋白水平的变化与血清铁浓度呈正相关，可能反映了铁饱和转铁蛋白对Tfr2的稳定作用。
本研究得出结论：Mt2对铁调素表达的抑制需要肝细胞Neo1的参与。在体证据支持Mt2通过稳定Neo1并与之相互作用，而非将其切割降解，来抑制由Neo1/Hjv介导的BMP信号通路，从而设定铁调素的基础表达水平。同时，研究数据也表明Mt2可能还通过Neo1以外的其他靶点来微调铁调素表达。肝细胞Neo1的主要功能是设定铁调素表达的基础水平。这些发现揭示了铁稳态调控中MT2-NEO1轴的关键作用，为了解相关铁代谢疾病的机制提供了新的理论基础。该研究论文已发表在《Journal of Biological Chemistry》上。
