《Journal of Biological Chemistry》：A neural glycan HNK-1 is transferred to recipient cells via small extracellular vesicles
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本研究针对亨廷顿病中线粒体DNA损伤修复机制受损这一关键问题，揭示了糖酵解酶PFKFB3及其代谢产物F2,6BP在线粒体DNA修复中的新功能。研究人员发现F2,6BP是DNA末端处理酶PNKP的关键辅因子，其水平在HD患者线粒体中显著降低导致PNKP活性受损和mtDNA断裂积累。补充F2,6BP可恢复PNKP活性、线粒体基因组完整性和功能，并减少mHTT聚集，为HD治疗提供了新靶点。
在大脑这个精密运作的“指挥中心”里，神经元细胞的健康维系着我们的思维、记忆和行动能力。然而，对于一些遗传性神经系统疾病患者而言，某些神经细胞会逐渐走向死亡，导致机体功能不可逆地丧失。亨廷顿病（Huntington's disease, HD）就是这样一种常染色体显性遗传的神经退行性疾病，由亨廷顿蛋白（huntingtin, HTT）基因外显子1中的CAG重复序列异常扩展引起。尽管其遗传病因明确，但导致脑细胞死亡的深层分子机制仍笼罩在迷雾之中。
近年来，越来越多的证据将矛头指向了细胞的“能量工厂”——线粒体。科学家们发现，线粒体功能障1在HD的发生和发展中扮演着重要角色。线粒体拥有自己独立的基因组（mtDNA），但由于其靠近活性氧（ROS）产生位点且缺乏组蛋白保护，mtDNA更容易受到氧化损伤。这种损伤如果得不到及时修复，就会影响线粒体的能量生产等功能，最终触发细胞死亡通路。在众多DNA修复机制中，多核苷酸激酶3‘-磷酸酶（Polynucleotide kinase 3’-phosphatase, PNKP）是一个关键角色，它能够处理DNA链断裂末端不可连接的3‘-磷酸（3’-P）和5‘-羟基（5’-OH），为后续修复铺平道路。有趣的是，先前的研究发现，在HD患者的细胞核中，PNKP的活性显著降低，但这并非由于其蛋白量减少，而是与一种名为果糖-2,6-二磷酸（Fructose-2,6-bisphosphate, F2,6BP）的代谢物水平下降有关。F2,6BP是糖酵解关键调控酶6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3（PFKFB3）的产物。那么，在线粒体这个“细胞能量中心”内，是否也存在类似的调控机制？PFKFB3和F2,6BP是否同样影响着线粒体基因组的稳定性和健康？解答这些问题，对于深入理解HD病理过程和开发新的治疗策略至关重要。
为此，来自美国德克萨斯大学医学分部等机构的研究团队在《Journal of Biological Chemistry》上发表了他们的最新研究成果。他们深入探究了PFKFB3/F2,6BP-PNKP轴在HD线粒体DNA修复中的作用及其机制。为了开展这项研究，研究人员运用了多种关键技术方法：他们使用了来自HD患者死后脑组织（额叶皮层）以及亨廷顿病模型小鼠纹状体神经元细胞（Q-7, 野生型；Q-111, 突变型）；通过细胞组分分离技术获得纯净的线粒体提取物；利用免疫印迹（Western blot）和免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）分析蛋白表达和相互作用；通过体外酶活实验检测PNKP的3‘-磷酸酶活性；采用长片段扩增定量PCR（Long amplicon quantitative PCR, LA-qPCR）评估线粒体DNA链断裂积累；使用流式细胞术（FACS）结合TMRM染料评估线粒体膜电位，并利用Seahorse能量分析仪检测细胞线粒体呼吸功能；此外，还通过免疫荧光染色观察蛋白聚集和亚细胞定位。
研究结果
线粒体PNKP活性在HD中降低
研究人员首先检测了HD患者死后大脑额叶皮层线粒体提取物中PNKP的3‘-磷酸酶活性。结果显示，与健康对照组相比，HD患者样本中的PNKP活性显著降低。同时，HD患者脑组织中的线粒体活性氧（mtROS）水平更高，并且通过LA-qPCR检测发现，HD患者线粒体基因组中DNA链断裂（SBs）显著积累。这些结果表明，在HD病理条件下，线粒体PNKP（mtPNKP）活性受损，导致mtDNA损伤加剧。
HD患者中PFKFB3和F2,6BP水平降低破坏了线粒体PNKP活性
既然PNKP的蛋白水平在HD中并未减少，那么其活性降低的原因何在？研究人员将目光投向了PFKFB3和F2,6BP。他们发现，PFKFB3不仅存在于细胞质和细胞核，也定位于线粒体中。在HEK293细胞、野生型小鼠纹状体神经元细胞（Q-7）以及健康人脑组织的线粒体提取物中均检测到了PFKFB3。进一步通过免疫共沉淀实验证明，在线粒体中，PFKFB3与PNKP、线粒体DNA聚合酶γ（POLG）、连接酶IIIα（Lig IIIα）以及HTT蛋白形成了一种DNA修复复合物。重要的是，在HD模型细胞（Q-111）和HD患者脑组织的线粒体提取物中，PFKFB3的蛋白水平显著降低，而PNKP蛋白水平不变。与此一致，HD患者线粒体中的F2,6BP水平也显著低于健康对照。这表明，线粒体中PNKP活性的降低是由于其辅因子F2,6BP的减少所致。
HD中线粒体功能失调
线粒体健康直接影响细胞存活。研究人员评估了HD模型细胞的线粒体功能。通过流式细胞术检测线粒体膜电位探针TMRM的荧光强度，发现Q-111细胞的线粒体膜电位明显低于Q-7细胞。使用不依赖于膜电位的MitoView?650染料对从脑组织中分离的纯线粒体进行分析，发现HD样本的线粒体呈现异质性群体，而健康对照则为均一群体，提示HD线粒体存在功能和健康状态的异常。此外，Q-111细胞中的mtROS水平更高。通过Seahorse能量代谢分析仪检测细胞耗氧率（OCR），发现Q-111细胞的基线呼吸、最大呼吸能力和备用呼吸容量均显著降低。这些数据综合表明，HD中线粒体功能严重受损。
外源性F2,6BP通过直接结合恢复线粒体PNKP活性
关键问题在于，补充F2,6BP能否挽救线粒体的缺陷？研究人员首先通过荧光淬灭实验证实，纯化的PNKP蛋白能够直接与F2,6BP结合，解离常数（Kd）为525 ± 25 nM，而结构相似的代谢物果糖-1,6-二磷酸（F1,6BP）即使在更高浓度下也不与PNKP结合，显示了相互作用的特异性。接着，他们在体外将F2,6BP加入到HD患者或Q-111细胞的线粒体提取物中，发现PNKP的3‘-磷酸酶活性以剂量依赖的方式得到恢复，而F1,6BP或果糖-6-磷酸（F6P）则无此效果。更令人鼓舞的是，当使用细胞穿透肽将F2,6BP递送到Q-111细胞内后，不仅线粒体PNKP活性得到恢复，线粒体基因组的完整性（通过LA-qPCR评估）也显著改善。
外源性F2,6BP抑制病理性HTT聚集体的形成
亨廷顿病的一个标志性病理特征是突变亨廷顿蛋白（mHTT）在细胞内形成有毒的聚集体。研究人员想知道，恢复线粒体功能是否能减轻这种蛋白病理。他们使用硫黄素T（ThT）染料和特异性识别mHTT聚集体的MW8抗体进行染色，发现Q-111细胞中存在大量的mHTT聚集体。而用F2,6BP处理后，这些聚集体的形成被显著抑制。同时，F2,6BP处理还部分恢复了Q-111细胞中PFKFB3的线粒体水平，增强了PFKFB3与PNKP的相互作用，并改善了线粒体膜电位，降低了mtROS水平，提升了线粒体呼吸功能。
补充F2,6BP恢复果蝇HD模型中的线粒体DNA完整性
为了在活体模型中验证F2,6BP的疗效，研究人员利用了HD果蝇模型（神经元特异性表达128个CAG重复的Htt片段）。他们发现，与对照果蝇相比，HD模型果蝇的线粒体DNA损伤增加。而通过食物补充F2,6BP后，模型果蝇线粒体基因组的完整性得到了显著恢复。这进一步支持了F2,6BP在体内修复线粒体DNA损伤的能力。
研究结论与意义
这项研究揭示了代谢与DNA修复在细胞器水平上的一种新颖且精细的关联。它首次证实了糖酵解酶PFKFB3及其产物F2,6BP在线粒体DNA修复中发挥着至关重要的作用。在亨廷顿病的病理环境下，线粒体内PFKFB3和F2,6BP水平的下降，直接导致关键DNA修复酶PNKP的活性受损，进而引发线粒体DNA损伤的累积、线粒体功能障碍（包括膜电位下降、呼吸能力减弱、ROS增多）以及mHTT病理性聚集体的形成。
研究的突破性发现在于，一种众所周知的糖酵解调控分子F2,6BP，竟然是PNKP酶的专用辅因子，对其DNA修复活性至关重要。通过补充外源性F2,6BP，能够有效逆转HD细胞模型和果蝇模型中的线粒体DNA损伤和部分功能异常，甚至减少致病蛋白聚集，这为亨廷顿病的治疗开辟了全新的思路。这种基于内源性代谢物的“由内而外”的治疗策略，理论上可能具有更好的生物相容性和更低的副作用。
总之，该研究不仅深化了我们对亨廷顿病分子机制的理解，将代谢紊乱、DNA修复缺陷和线粒体功能障碍有机地联系起来，更重要的是，它指出了F2,6BP或其类似物作为潜在治疗药物的巨大前景，为开发延缓或改善亨廷顿病及其他相关神经退行性疾病进展的新疗法奠定了坚实的理论基础。
