《Journal of Bioscience and Bioengineering》：Biosynthesis of poly(6-hydroxyhexanoate) [poly(ε-caprolactone)] using engineered polyhydroxyalkanoate synthetic system in
Escherichia coli
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生物合成聚己内酯（PCL）的新方法：通过工程化聚羟基烷酸酯合酶（PhaC）系统在E. coli中利用6-羟基己酸内酯（6HHx）合成PCL，并发现F313Y突变体提高了PCL产量及共聚物合成能力，NMR和质谱验证了产物结构。
柳川健吾（Kengo Yanagawa）|八束真一（Shin-ichi Hachisuka）|草本春野（Haruno Kusumoto）|山本和树（Kazuki Yamamoto）|古川祥子（Shoko Furukawa）|佐佐木守（Mamoru Sasaki）|伊关京吾（Kyogo Iseki）|中川直也（Naoya Nakagawa）|中野翔吾（Shogo Nakano）|菊川宏（Hiroshi Kikukawa）|松本健一郎（Ken’ichiro Matsumoto）
北海道大学化学科学与工程学院，日本札幌市北区N13W8，邮编060-8628
聚ε-己内酯（PCL），又称聚(6-羟基己酸酯) [P(6HHx)]，是一种可生物降解的聚酯，具有优异的柔韧性、加工性能和海洋降解性，使其成为传统塑料的有前景的替代品。然而，目前PCL的化学合成方法依赖于金属催化的ε-己内酯开环聚合反应，这引发了人们对金属污染和环境可持续性的担忧。在这里，我们报道了一种利用工程化的聚羟基烷酸酯（PHA）系统在大肠杆菌中合成PCL [P(6HHx)]的生物方法。通过全一致性设计算法设计了一种人工PHA合成酶（PhaC，即FcPhaC4），以增强其结构稳定性和底物特异性，并用于聚合物的生产。表达FcPhaC4的大肠杆菌在添加了6HHx合成聚合物的情况下进行培养，通过1H/13C核磁共振和基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱分析确认该聚合物为PCL。FcPhaC4的F313Y突变体进一步提高了PCL的产率。此外，利用这些酶还可以合成所需单体组成的随机共聚物P(3-羟基丁酸-6HHx)。体外实验表明，FcPhaC4及其突变体能够以6HHx-CoA作为唯一底物发挥活性，这与它们生成均聚物的能力一致。这些结果表明，FcPhaC4是首个能够生物合成PCL均聚物的酶。
媒体资料
试剂
除非另有说明，所有试剂均购自FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation（日本大阪）、Junsei Chemical Co.（日本东京）和Gibco（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。Luria–Bertani（LB）培养基含有10 g/L色氨酸、5 g/L酵母提取物和10 g/L NaCl。通过添加1.5%（w/v）的琼脂粉制备固体培养基。在聚合物生产过程中，以不同浓度添加3HB-Na和6HHx-Na作为单体前体。
3HB-Na溶液的制备方法如下：
利用FcPhaC4及其突变体进行体内聚合物合成
先前研究发现，PhaCAR中的F314Y突变体提高了6HHx单元的掺入量（13）。基于这一发现，构建了相应的突变体FcPhaC4 F313Y [FcPhaC4(FY)]。携带FcPhaC4或FcPhaC4(FY)的重组大肠杆菌在含有6HHx-Na和3HB-Na的培养基中培养。参与聚合物生产的代谢途径如图1所示：辅酶A（CoA）连接酶（AlkK）催化CoA与6HHx的连接，而丙酰-CoA转移酶（PCT）据报道不具备这种催化活性
CRediT作者贡献声明
柳川健吾：撰写初稿、方法设计、实验研究。八束真一：撰写、审稿与编辑、监督、方法设计、实验研究、资金筹集。草本春野：方法设计、实验研究。山本和树：方法设计、实验研究。古川祥子：实验研究。佐佐木守：实验研究。伊关京吾：方法设计、实验研究。中川直也：实验研究。中野翔吾：软件开发、资金筹集。菊川宏：撰写、审稿与编辑。
致谢
本研究得到了日本学术振兴会（JSPS）的资助（项目编号：25KJ0503（针对K.Y.）、20H04368（针对K.M.）、24H01153和25H01588（针对S.N.）；日本环境省提供的环境修复与保护机构环境研究和技术开发基金（项目编号：JPMEERF20241RB1，针对S.H.）；以及日本科学技术 Agency的ALCA-next计划（项目编号：JPMJAN25D1，针对K.M.）的支持。同时，我们也感谢全球设施中心的开放设施部门提供的帮助。
