《Journal of Bioscience and Bioengineering》：TNF-α-induced contractile dysfunction in three-dimensional engineered muscle
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3D人工肌肉模型揭示TNF-α通过破坏ECM、肌小节结构和钙信号通路导致收缩力显著下降，为肌萎缩症机制提供新证据。
田村幸則（Yukinori Tamura）| 石坂純平（Junpei Ishizaka）| 横山翔（Sho Yokoyama）| 冈池彩音（Ayune Ochi）| 草下康太（Kota Kishishita）| 中岛亮（Ryo Nakajima）| 坂井真帆（Maho Sakai）| 曾颖（Ying Zeng）| 冈川愛理（Airi Okugawa）| 樋口良辅（Ryosuke Higuchi）| 藤里敏也（Toshia Fujisato）| 水谷健一（Ken-ichi Mizutani）| 中村智宏（Tomohiro Nakamura）
日本神户学院大学营养学部生理学与生物化学系，地址：日本神户市西区池谷谷518号，邮编651-2180
三维工程肌肉（3D-EM）为研究骨骼肌功能提供了一个生理学上相关的模型。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是一种促炎细胞因子，在肌少症和恶病质等慢性疾病中其水平升高，与肌肉无力有关。然而，这一效应的机制尚不清楚。在本研究中，我们使用3D-EM系统评估了TNF-α对肌肉收缩力的直接影响。通过将C2C12肌母细胞接种到含有I型胶原蛋白的培养基上并经过15天的分化处理来构建3D-EM模型。随后将模型暴露于TNF-α环境中48小时或72小时，并在电脉冲刺激下测量其收缩力。通过免疫组化分析和RNA测序（RNA-seq）及后续的富集分析来评估组织结构和转录组变化。结果显示，与对照组相比，TNF-α在48小时后使收缩力降低了60%，72小时后降低了90%。免疫组化观察发现肌管萎缩，同时快速收缩纤维也发生了丢失。RNA-seq结合基因本体论（Gene Ontology）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）分析表明，TNF-α抑制了细胞外基质、肌节结构和钙信号通路的功能。这些结果表明，TNF-α通过破坏细胞外基质的完整性、肌节结构以及钙依赖性收缩机制来降低3D-EM模型的收缩力，且对快速收缩纤维的影响更为显著。总体而言，本研究为肌少症的发病机制提供了新的见解，并展示了3D-EM作为细胞因子诱导肌肉无力模型的实用性。
研究部分概述
细胞培养
C2C12肌母细胞来源于小鼠骨骼肌，由美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，位于美国弗吉尼亚州马纳萨斯）提供。细胞在含有高浓度葡萄糖的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；葡萄糖浓度4.5 g/L；Nacalai Tesque，日本京都）中培养，同时添加10%胎牛血清（Sigma–Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素（Nacalai Tesque）。培养条件为37°C、5%二氧化碳（CO?）的湿润环境。
TNF-α显著降低了3D-EM模型的收缩力
图2A显示了经过72小时TNF-α处理后，对照组和实验组3D-EM模型的外观。两组之间未观察到明显的形态学差异，且测量每个模型中点的宏观直径与基线值相比也没有显著变化（见图S1）。然而，功能评估显示电脉冲刺激下的收缩力明显减弱。
讨论
本研究证实TNF-α显著降低了3D-EM模型的收缩力，并导致肌管萎缩，尤其是快速收缩纤维的丢失。转录组和qRT-PCR分析进一步表明，TNF-α抑制了与肌节结构、细胞外基质组织和钙信号传导相关的基因表达。免疫组化结果显示Z线结构受损，被动力-长度分析也显示模型的硬度降低。
作者贡献声明
田村幸則（Yukinori Tamura）： 文章撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、结果验证、项目监督、资金申请、数据分析、概念构思。
石坂純平（Junpei Ishizaka）： 数据可视化、结果验证、实验设计、数据分析。
横山翔（Sho Yokoyama）： 文章撰写、审稿与编辑、实验资源准备、方法学设计。
冈池彩音（Ayune Ochi）： 结果验证、实验设计、数据管理。
草下康太（Kota Kishishita）： 实验设计。
中岛亮（Ryo Nakajima）： 实验实施。
坂井真帆（Maho Sakai）：
致谢
我们感谢大阪大学微生物疾病研究所的NGS核心设施在RNA测序方面提供的支持。本研究得到了日本学术振兴会（JSPS）科研基金（项目编号JP22K11892，资助对象为Y.T.）和兵库县COE研究计划（资助对象为K.M.）的资助。
作者声明不存在任何利益冲突。
