《Journal of Biological Chemistry》：Inhibition of cell surface GRP78 on brain tumors reverses drug resistance and stops cancer stem cell expansion
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本研究针对脑肿瘤复发率高、耐药性强的临床难题，创新性地聚焦于细胞表面GRP78的关键作用。研究人员通过开发特异性GRP78抑制剂CBT300，证实其可有效消除癌蛋白ROR1、Cripto及免疫检查点蛋白PD-L1的表达，从而逆转化疗耐药、抑制干细胞扩增并克服免疫抑制，在临床前模型中显著延长荷瘤小鼠生存期并实现肿瘤消退，为脑癌治疗提供了新靶点与新策略。
尽管采用了包括最大范围手术切除、立体定向放射外科、全脑放疗、化疗、分子靶向治疗和免疫疗法在内的积极治疗手段，许多脑癌患者的复发率仍接近100%。尤其对于儿童脑癌类型，如弥漫性内生性桥脑胶质瘤（DIPG）和胶质母细胞瘤（Glioblastoma），患者的中位生存期甚至不足一年。这种不可避免的复发，源于对药物和免疫具有抵抗性的胶质瘤干细胞（GSCs）的逃逸和扩增。这些GSCs与脑肿瘤微环境（TME）存在协同共生关系，而缺氧、低葡萄糖的TME在胶质瘤发生发展、生长和耐药性的早期及晚期阶段均扮演重要角色。
在这一背景下，一种名为葡萄糖调节蛋白78（GRP78）的新型生存因子引起了研究人员的关注。在正常细胞中，GRP78是内质网（ER）驻留蛋白，负责协助蛋白质折叠并靶向错误折叠蛋白以进行ER相关降解。然而，在应激条件下的肿瘤和基质细胞中，GRP78会从ER释放并易位至细胞表面。与细胞内GRP78相比，细胞表面GRP78被定义为一种应激诱导因子，可导致脑肿瘤的侵袭性生长、化疗耐药、放射抵抗和干细胞扩增。研究表明，细胞表面GRP78在乳腺癌、肺癌、脑癌、前列腺癌、结肠癌、多发性骨髓瘤、肾癌和卵巢癌中的表达水平远高于正常组织，并且其表达增加与脑肿瘤分期晚、对放化疗抵抗、转移增加和侵袭性强相关。
此前研究曾表明，使用K5抑制脑肿瘤细胞表面的GRP78可诱导肿瘤细胞凋亡并抑制血管生成。然而，这些研究均未证明系统性给药的、特异性细胞表面GRP78抑制剂能直接导致脑肿瘤消退，且细胞表面GRP78诱导耐药和免疫抑制的机制仍不清楚。本研究旨在阐明细胞表面GRP78如何诱导这些促肿瘤效应，以及如何逆转这些效应。
为了特异性抑制仅位于细胞表面的GRP78，研究人员设计并测试了多种GRP78抑制剂，包括CBT100、CBT200和CBT300。研究发现，这些GRP78抑制剂能够使儿童和成人脑肿瘤神经球消退，并消除ROR1、Cripto和PD-L1的表达，从而导致肿瘤细胞凋亡。在临床前原位脑肿瘤小鼠模型中，系统性给药GRP78抑制剂抑制细胞表面GRP78，与对照组小鼠相比，显著提高了40-70%治疗小鼠的总生存期并实现了持久的肿瘤消退。
本研究的关键发现在于，细胞表面GRP78能结合并稳定一种名为受体酪氨酸激酶样孤儿受体1（ROR1）的新型跨膜酪氨酸激酶、一种名为Cripto的癌胚因子以及一种名为PD-L1的免疫检查点蛋白。进一步机制探究揭示，ROR1通过其kringle结构域与GRP78结合，其结合亲和力（Kd = 17.5 nM）比先前已知的K5（Kd = 260 nM）强15倍。基于此，研究人员开发了新型胞外和表面GRP78抑制剂Kr1Fc（即CBT300），该融合蛋白因其优异的GRP78结合亲和力（Kd = 0.3 nM）、长半衰期（小鼠皮下给药半衰期达11天）和高纯度（>99%）而成为先导候选药物。
实验证明，CBT300能有效逆转由胞外GRP78诱导的化疗耐药。在成人GBM细胞系（如U87）和儿童DIPG细胞系（如DIPG13）中，添加胞外GRP78可使多柔比星（Doxorubicin）的IC50值增加4-20倍，而加入低剂量的CBT300（0.1 nM）则可使其敏感性恢复10倍以上。更重要的是，在更接近体内肿瘤状态的3D神经球模型中，CBT300单药或与低剂量多柔比星联用，能显著促使已建立的患者来源胶质瘤神经球消退超过90%，并协同增强多柔比星在胶质瘤细胞内的内化。
机制上，CBT300通过消除细胞表面GRP78，进而显著降低ROR1、Cripto-1和PD-L1等蛋白在肿瘤细胞表面的表达。流式细胞术和免疫组织化学分析证实，CBT300处理后，细胞表面GRP78、ROR1、Cripto和PD-L1的表达量下降超过73%-99%。同时，与多药耐药相关的药物外排泵（如ABCB1/P-gp, ABCC1/MRP-1, ABCG2/BCRP）的表达也显著降低。此外，CBT300还能诱导患者来源的胶质瘤干细胞（如827细胞）发生细胞死亡。
在动物模型验证中，系统性给予GRP78抑制剂（K5通过微型泵，或CBT300通过皮下注射）在植入人患者来源成人D54 GBM细胞或PDx CTG-2687 GBM干细胞的原位脑肿瘤裸鼠模型中，显示出显著的抗肿瘤效果。K5高剂量组（10 mg/kg/天）超过30%的小鼠出现肿瘤完全消退，且总生存期显著延长。CBT300治疗组（100 mg/kg/天）则使60%的荷瘤小鼠肿瘤完全消退，并显著延长生存期7天。重要的是，治疗未观察到明显毒性。
研究人员为开展此项研究，主要应用了以下几项关键技术方法：利用患者来源的成人及儿童高级别胶质瘤（包括DIPG和GBM）干细胞系进行体外功能研究；通过蛋白质pull-down、质谱分析、直接ELISA和计算机模拟分子对接等技术鉴定GRP78与细胞表面蛋白（ROR1、Cripto、PD-L1）的相互作用及其结合域；采用2D细胞活力检测（CCK-8法）和3D神经球培养模型评估药物敏感性及肿瘤消退效果；利用流式细胞术和免疫荧光/组织化学分析检测细胞表面蛋白表达及药物内化；并通过原位脑肿瘤小鼠模型，结合磁共振成像（MRI）和生物发光成像（IVIS）等技术，进行体内药效和生存分析评价。
细胞表面GRP78结合增强脑肿瘤细胞对多柔比星的耐药性
为了确定胞外GRP78是否能直接结合肿瘤细胞以增加化疗耐药性和存活率，研究人员在有或无胞外GRP78（5 μg/ml）的情况下，进行了多柔比星的细胞活力试验。结果显示，胞外GRP78使U87MG细胞对多柔比星的耐药性增加5倍，U118细胞增加7倍，DIPG13细胞增加20倍。[](@replace=1)
GRP78与脑肿瘤细胞表面的受体ROR1、Cripto和PD-L1结合
为了解胞外GRP78如何结合癌细胞表面并诱导化疗耐药，研究人员使用C末端带His标签的GRP78进行pull-down实验。结果从儿科SF9402 DIPG干细胞和成人U87 GBM细胞表面，鉴定出GRP78结合受体ROR1，以及已知的细胞表面GRP78结合蛋白Cripto和PD-L1。流式细胞术证实超过半数的SF9402和U87细胞表达ROR1。直接ELISA结合实验显示，ROR1、Cripto和PD-L1的胞外结构域与GRP78的结合亲和力均在皮摩尔级别，远高于CD44（纳摩尔级别）。[](@replace=2)
ROR1、PD-L1和Cripto在患者脑肿瘤组织中高表达且与细胞表面GRP78邻近
通过患者脑肿瘤组织微阵列的免疫荧光染色分析，发现ROR1、PD-L1和Cripto与细胞表面GRP78在晚期GBM患者肿瘤组织中共同定位（叠加后显示黄色），而在正常脑组织中表达较低，这验证了pull-down和体外细胞实验的结果。[](@replace=3)
ROR1通过其kringle结构域与GRP78结合
对ROR1胞外结构域的分析发现其含有一个kringle结构域。实验证实，ROR1中唯一能与GRP78结合的胞外结构域是其kringle结构域（Kr1），其与GRP78的结合亲和力（Kd = 17.5 nM）比K5（Kd = 260 nM）强15倍。计算机模拟分子对接也预测GRP78与ROR1 kringle结构域能够结合。[](@replace=4)
新型胞外和表面GRP78抑制剂Kr1Fc（CBT300）的开发
为解决K5半衰期短的问题，研究人员创建了新型kringle融合蛋白CBT300（Kr1Fc）。CBT300表现出更高的GRP78结合亲和力（Kd = 0.3 nM），更长的半衰期（小鼠皮下给药半衰期11天），并且纯度超过99%，无明显聚集，优于CBT100（K5Fc）。[](@replace=5)
CBT300在降低成人脑肿瘤细胞系活力方面比K5、CBT100和CBT200更有效
在成人GBM细胞系（U87）的五天活力测定中，CBT300抑制肿瘤细胞活力的IC50值为2.5 nM，其效力分别是K5的195倍、CBT200（K5PEG）的45倍和CBT100（K5Fc）的20倍。[](@replace=6)
CBT300降低儿童和成人患者来源脑肿瘤细胞的活力
CBT300在多种儿童和成人患者来源的胶质瘤细胞系（包括儿科GBM细胞SF9402、SF9427以及儿科DIPG细胞SF8628、DIPG13、DIPG38、DIPG50）中，均能在低纳摩尔浓度下显著降低细胞活力。对于在层粘连蛋白上生长的患者来源胶质瘤干细胞（827），CBT300也能显著增加细胞死亡。[](@replace=7)
CBT300单用或与多柔比星联用可显著使已建立的患者来源胶质瘤神经球消退超过90%
在3D神经球模型中，CBT300单药治疗能使儿童DIPG神经球显著消退60%至100%。CBT300与低剂量多柔比星联用，对U118神经球显示出显著的协同消退效应（97%抑制）。对于患者来源的GSC827细胞，CBT300在7天内使神经球数量显著减少30%。[](@replace=8)
CBT300消除胶质瘤细胞上的GRP78、ROR1、Cripto和PD-L1表达
流式细胞术分析表明，添加胞外GRP78可上调胶质瘤细胞表面GRP78表达2.4倍，而加入CBT300 24小时后，可消除SF9427细胞97%和U87细胞73%的表面GRP78表达，并导致ROR1、Cripto和PD-L1表达相应显著降低。[](@replace=9)
CBT300增强多柔比星在儿童和成人胶质瘤细胞内的内化
实验发现，胞外GRP78与细胞结合后，使多柔比星的内化显著减少近50%。然而，当向细胞中加入CBT300后，内化多柔比星的细胞数量 dramatically 增加了250%以上。免疫组织化学分析验证了这一结果。[](@replace=10)
GRP78抑制剂K5系统性给药可在小鼠体内导致原位脑肿瘤完全消退并提高总生存期
在植入人患者来源成人D54 GBM细胞的原位神经胶质瘤裸鼠模型中，通过微型泵系统性给予K5（10 mg/kg/天）显示，超过30%（5/15）的小鼠肿瘤完全消退，并且总生存期显著延长。低剂量K5（1 mg/kg/天）虽能延长生存期约40-45%，但未观察到肿瘤消退。组织化学分析显示，K5治疗显著降低了肿瘤血管密度（CD31染色减少93%），并增加了肿瘤/内皮细胞凋亡（TUNEL染色增加7倍）。[](@replace=11)
系统性皮下注射CBT300（Kr1Fc）可导致患者来源异种移植（CTG-2687）胶质母细胞瘤肿瘤消退并改善小鼠生存期
在患者来源异种移植（PDx）原位免疫缺陷小鼠肿瘤研究中，皮下注射CBT300（100 mg/kg/天）可使平均脑肿瘤体积减少75%，60%的已建立CTG-2687 GBM肿瘤的小鼠出现完全缓解，并显著延长60%治疗小鼠的生存期。[](@replace=12)
CBT300可穿过血肿瘤屏障，循环浓度约2.2 μM，并降低PDx脑肿瘤细胞上细胞表面GRP78、ROR1、Cripto、MRP-1、MDR-1和BCRP的表达
对小鼠脑肿瘤组织的染色显示，约60%的细胞有CBT300结合。CBT300治疗显著降低了肿瘤细胞表面GRP78（>99%）、ROR1（>99%）、PD-L1（93%）、Cripto（98%）以及多药耐药蛋白ABCC1/MRP-1（95%）、ABCB1/P-gp（>99%）和ABCG2/BCRP（95%）的表达。CBT300在血液中的循环浓度约为2.2 μM。[](@replace=13)
本研究得出结论，抑制细胞表面GRP78能够逆转由肿瘤微环境应激诱导的多重促肿瘤特性。具体而言，CBT300通过高亲和力结合并消除细胞表面GRP78，破坏了其对于ROR1、Cripto和PD-L1等关键蛋白的稳定作用。这一作用直接导致了化疗增敏（通过下调药物外排泵表达）、癌症干细胞扩增抑制以及肿瘤免疫逃逸的逆转。临床前研究数据充分证明，靶向细胞表面GRP78，特别是使用CBT300这类具有良好药学特性的抑制剂，能够显著抑制脑肿瘤生长、诱导肿瘤消退并延长生存期，且未观察到明显毒性。该研究不仅阐明了细胞表面GRP78在脑肿瘤恶性进展中的核心作用机制，更重要的是为克服当前脑癌治疗中面临的耐药性和高复发率难题提供了极具前景的新治疗策略，有望为成人及儿童脑癌患者带来新的希望。这项研究已发表在《Journal of Biological Chemistry》上。
