《Journal of Biological Chemistry》：O-GlcNAcase promotes dendritic spine morphogenesis while downregulating their GluA2-containing AMPA receptors
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本研究旨在阐明O-GlcNAcase (OGA)在兴奋性突触可塑性中的未知功能。研究人员通过免疫组化、生化分析和功能实验发现，OGA不仅定位于树突棘并促进其成熟和密度增加，还通过下调含GluA2亚基的AMPA受体(AMPAR)来调节突触大小和受体组成。该研究揭示了OGA作为兴奋性突触重塑的关键调节因子，为阿尔茨海默病、自闭症等突触相关病理提供了新的治疗靶点。
在我们的大脑中，数以亿计的神经元通过名为突触的特殊连接点进行交流，而树突棘——这些微小的突起结构——正是兴奋性突触的主要所在地。它们如同精致的信号接收站，其形态、密度和分子组成直接影响着突触可塑性，即突触根据神经活动强度或弱化的能力，这是学习、记忆和认知功能的基础。许多与突触可塑性相关的蛋白质都会受到一种名为O-连接N-乙酰葡糖胺化(O-GlcNAcylation)的翻译后修饰的调控。这是一种动态可逆的过程，由两种酶精密调控：O-连接N-乙酰葡糖胺转移酶(OGT)负责添加O-GlcNAc，而O-连接N-乙酰葡糖胺水解酶(OGA)则负责将其移除。尽管OGT在突触功能中的作用已有不少探索，但OGA在树突棘和突触层面的具体角色，尤其是在调节关键兴奋性神经递质受体——AMPA受体方面的作用，仍然笼罩在迷雾之中。理解OGA如何精细调控突触结构和功能，对于揭示阿尔茨海默病、自闭症谱系障碍等神经发育和退行性疾病的病理机制至关重要，这些疾病通常伴随着树突棘的异常。因此，探究OGA的功能，不仅是神经科学基础研究的重要一环，也具有潜在的临床应用前景。本研究论文发表于《Journal of Biological Chemistry》。
研究人员主要运用了以下几项关键技术来探究OGA的功能：利用原代海马神经元和小鼠脑组织进行细胞培养与生化分馏；通过质粒转染在神经元中过表达OGA进行功能获得性研究；采用免疫组织化学/免疫荧光技术进行蛋白定位和形态学分析（如Sholl分析和树突棘分析）；通过Western印迹和免疫共沉淀进行蛋白表达水平和相互作用的定量检测；使用共聚焦显微镜成像并利用Imaris软件进行三维重建和量化分析。
OGA定位于树突棘
研究人员首先通过免疫组织化学分析小鼠海马组织切片，发现OGA蛋白存在于神经元的树突区域。进一步的生化分馏和Western印迹分析显示，OGA存在于大多数亚细胞组分中，但在突触体特别是突触后致密物(PSD)中的含量相对较低。通过在海马神经元中转染绿色荧光蛋白(GFP)和OGA并进行免疫染色，直接观察到内源性和外源性OGA均在树突和树突棘中富集，且在成熟棘中的强度高于未成熟棘。这些结果明确了OGA在树突棘中的存在。
过表达OGA影响整体神经元形态
为了研究OGA的功能，研究者在培养的海马神经元中过表达了OGA。免疫细胞化学证实过表达成功降低了细胞体内的O-GlcNAc水平。通过Sholl分析评估树突复杂性，发现过表达OGA会导致树突分支减少，表明OGA能影响神经元的整体形态。
OGA促进发育中神经元的成熟树突棘
在神经元发育早期（体外培养第7天, DIV7）过表达OGA，发现总树突棘密度显著增加。虽然成熟棘（蘑菇状，头宽较大）与总棘的比值、未成熟棘（细长状）与总棘的比值没有显著变化，但成熟棘的绝对数量显著增加，而未成熟棘数量不变。这表明OGA在发育早期主要促进树突棘的成熟。
OGA减小发育中神经元的突触大小
利用突触前标记vGluT1和突触后标记PSD-95进行免疫荧光染色和三维分析，发现过表达OGA并不改变PSD-95或vGluT1斑点的数量。然而，vGluT1斑点（突触前）的大小显著减小，与PSD-95共定位的vGluT1斑点的荧光强度也降低。同时，非共定位的PSD-95斑点尺寸反而增大。这些结果表明OGA过表达导致兴奋性突触尺寸减小，主要影响了突触前结构。
OGA促进成熟神经元的树突棘数量
在较成熟的神经元（DIV14）中过表达OGA，也观察到树突棘密度增加的趋势。深入分析发现，未成熟棘的绝对数量显著增加，而成熟棘数量无显著变化。这说明OGA在成熟神经元中主要促进了树突棘（尤其是未成熟棘）的形成。
OGA减小成熟神经元的突触大小
在DIV14的神经元中，OGA过表达同样不改变PSD-95或vGluT1斑点的密度。但PSD-95（突触后）和vGluT1（突触前）斑点的尺寸、荧光强度以及两者重叠的体积均显著减小。这进一步证实OGA在成熟神经元中也起到减小突触大小的作用。
OGA调节AMPAR亚基组成和突触表达
AMPA受体(AMPAR)是介导快速兴奋性突触传递的关键分子，其亚基组成（如GluA1, GluA2, GluA3）直接影响受体的功能特性（如钙离子通透性）和突触稳定性。研究发现，在发育中神经元（DIV7）过表达OGA，树突棘中GluA1水平升高，而GluA2和GluA3水平降低。在成熟神经元（DIV14）中，GluA2水平持续降低，GluA1水平也下降，而GluA3水平升高。这表明OGA对AMPAR亚基组成的调控具有发育阶段特异性，但均一致地下调了GluA2。为了验证O-GlcNAc水平降低是主要原因，研究人员在OGT条件性敲除的神经元中（导致O-GlcNAc水平降低）进行了生化分析。结果显示，OGT敲除增加了总膜表面GluA1表达，但降低了GluA2和GluA3的表达。免疫共沉淀实验进一步证实，OGT敲除后与GluA1结合的GluA2相对量减少。这些生化证据与成像结果一致，表明降低O-GlcNAc水平（无论是通过过表达OGA还是敲除OGT实现）会减少含GluA2的AMPAR（包括GluA1/2和GluA2/3异聚体），从而可能促进不含GluA2的钙离子通透性AMPAR的形成。
本研究系统性地揭示了OGA在调节兴奋性突触结构和功能中的关键作用。OGA通过影响O-GlcNAc循环，不仅调控树突棘的成熟和数量，还减小了突触的尺寸，并特异性地下调了突触中含GluA2亚基的AMPA受体。这种受体组成的改变可能增加突触的钙离子通透性，进而影响与突触可塑性相关的信号通路和细胞骨架重塑。研究结果表明，OGA是兴奋性突触重塑的一个重要调节因子，其功能的阐明为了解O-GlcNAc修饰在神经系统中的作用提供了新的视角。尤其重要的是，由于OGA相较于OGT更易于进行药理学靶向，该研究为开发针对阿尔茨海默病、自闭症等与突触功能障碍密切相关疾病的新的治疗策略提供了有价值的理论依据和潜在的分子靶点。
