《Journal of Biotechnology》：Couple action of some proteases from feather keratin-degrading bacterium
B.licheniformis CP-16
编辑推荐：
角蛋白降解|Bacillus licheniformis CP-16|蛋白酶协同作用|二硫键还原酶|羽毛资源化
罗世金|王德山|杨凯格|叶辉|孙英霞|齐志国|左建军|张铁英
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摘要
从羽毛废料中分离出一种能够降解角蛋白的细菌Bacillus licheniformis CP-16，该菌产生三种具有蛋白酶活性的细胞外蛋白。通过质谱测序和BLAST分析，这些蛋白分别与γ-谷氨酰转肽酶、碱性丝氨酸蛋白酶和类硫氧还蛋白YkuU具有高度相似性。从B. licheniformis中提取的这三种蛋白及Ker A基因被成功克隆到pET22b载体中，并在大肠杆菌（E. coli）中表达，这四种重组酶分别被命名为P-Glu、P-Alk、P-Trx和P-Ker。P-Ker表现出较强的角蛋白酶活性（4.9 kU/mg）和酪蛋白酶活性（6.5 kU/mg），而P-Alk的角蛋白酶活性为（1.2 kU/mg），酪蛋白酶活性为（23 kU/mg）。相比之下，P-Glu和P-Trx的角蛋白酶和酪蛋白酶活性较低。P-Trx还具有二硫键还原酶活性（3 U/mg）。当P-Trx与其他三种蛋白酶（P-Glu、P-Alk、P-Ker）混合时，它们的角蛋白酶活性分别提高了71%、40%和71%。商业蛋白酶（胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶）与P-Trx混合后也表现出角蛋白分解能力。这些发现揭示了P-Trx与其他蛋白酶在降解羽毛角蛋白过程中的新型协同机制，从而提高了角蛋白的分解效率。
引言
角蛋白是一种不溶于水的结构蛋白，存在于脊椎动物的外层皮肤及其衍生物中，如羽毛、毛发和指甲（Daroit和Brandelli，2014）。角蛋白中的广泛交联使其难以被胰蛋白酶和胃蛋白酶等常见蛋白酶降解，但可以通过一类称为角蛋白酶的特定酶有效分解（Papadopoulos，1986）。
利用角蛋白酶对家禽副产品进行生物降解提供了一种环境可持续的生物技术解决方案，可将这种丰富的废弃物转化为经济实惠且营养丰富的动物饲料（Mazotto等，2011）。此外，角蛋白酶在多个行业中得到广泛应用，包括羽毛回收、皮革加工、纺织、饲料生产、肥料制造和化妆品领域（Brandelli等，2010；Gupta等，2013b；Lotfi等，2022）。这些酶具有广泛的底物特异性，因此与普通蛋白酶不同，它们对不溶性角蛋白（例如羽毛角蛋白）的酶活性超过50%，而对可溶性蛋白（如酪蛋白）的酶活性较低（Brandelli等，2010；Gupta和Ramnani，2006）。许多丝氨酸蛋白酶具有角蛋白分解活性（B?ckle等，1995；Bressollier等，1999；Descamps等，2003；Jaouadi等，2010；Kumar等，2008），因此角蛋白酶和蛋白酶之间的界限并不明显。
然而，角蛋白的降解机制尚未完全明了。鉴于角蛋白的结构复杂性和生化特性，很可能有多种类型的蛋白酶共同参与其降解过程，其中二硫键的断裂在促进角蛋白降解中起关键作用（Bockle和Muller，1997；Prakash等，2010；Rahayu等，2012；Ramnani等，2005；Yamamura等，2002）。例如，在Vibrio菌株kr2生长于羽毛角蛋白时观察到了二硫键的还原现象（Sangali和Brandelli，2000）。同样，Streptomyces pactum和Bacillus megaterium在降解羽毛过程中也表现出二硫键的还原作用（Bockle和Muller，1997；Swerdlow和Setlow，1983）。Stenotrophomonas sp.菌株D-1产生两种细胞外蛋白：一种丝氨酸蛋白酶和一种二硫键还原蛋白，后者被认为具有二硫键还原酶的功能（Yamamura等，2002）。
在本研究中，我们筛选出一种能够降解羽毛的细菌，该菌在羽毛培养基中表现出强烈的角蛋白降解和二硫键还原活性。通过色谱法、SDS-PAGE和明胶酶谱分析，我们提取并测序了一些蛋白酶的基因，并在E. Coli中表达这些蛋白酶，以便进一步研究它们的特性及其在羽毛角蛋白降解中的作用。
部分内容摘要
从羽毛废料中分离出能够降解角蛋白的细菌
为了筛选产生角蛋白酶的细菌，将1克羽毛废料样品接种到LB培养基中，于37℃、150 rpm条件下培养24小时，然后取100 μL稀释后的样品涂布在pH 7.5的羽毛粉琼脂平板上。平板在37℃下培养2-3天。测量细菌菌落周围的水解区直径，并选择具有较大透明区的菌落进行进一步研究。部分菌落因降解能力较弱而被淘汰。
降解羽毛角蛋白的细菌的分离
经过多次筛选后，逐步富集并分离出能够降解羽毛角蛋白的菌株。通过羽毛粉琼脂平板筛选，最终分离出一种菌株，该菌株能够在培养基中以羽毛角蛋白为唯一的碳源和氮源。目前，该菌株已在中国农业科学院动物科学研究所登记，登记号为IASZTYCP-16。
讨论
从家禽废料中分离出一种能够降解羽毛的细菌。根据形态特征和16S rDNA系统发育分析，该菌株属于B. licheniformis，被鉴定为B. licheniformis CP-16。许多能够降解角蛋白的B. licheniformis菌株已从家禽废料和废水中被分离出来（Ramnani等，2005；Williams等，1990）。一些革兰氏阳性细菌（如Bacillus和Streptomyces）也被发现具有降解羽毛的能力（B?ckle等，1995；Lin等
结论
本研究鉴定了从家禽废料中分离出的降解羽毛的细菌B. licheniformis CP-16，其显著的角蛋白降解能力得到了证实。CP-16在四天内即可有效降解羽毛，性能优于其他B. licheniformis菌株（如PWD-1）。该菌株的角蛋白酶活性及其产生的二硫键还原酶强调了蛋白水解和亚硫酸盐水解系统在角蛋白降解中的作用。
此外，我们还发现了...
CRediT作者贡献声明
左建军：撰写——初稿修订与编辑、监督、方法学设计。罗世金：撰写——初稿撰写、验证、方法学设计、数据管理、概念构建。王德山：撰写——初稿撰写、验证、方法学设计、数据管理。张铁英：撰写——初稿修订与编辑、监督、资源协调。杨凯格：撰写——初稿撰写。叶辉：软件开发、方法学设计、数据分析。孙英霞：软件应用、方法学设计。齐志国：项目管理、方法学设计。
利益冲突声明
作者声明本研究过程中不存在任何可能构成利益冲突的商业或财务关系。
我们确认已阅读并理解《生物技术杂志》的利益冲突政策，所有作者对研究内容负最终责任。同时声明本手稿的撰写过程中未使用任何人工智能辅助技术。
我们理解...
致谢
本研究得到了中国国家自然科学基金（31470122）、国家重点研发计划（2021YFD1301004）、中国农业科学院科技创新专项基金（ASTIP-IAS08）以及国家动物营养与饲料重点实验室（2004DA125184F2503）的支持。
利益冲突
作者声明本研究过程中不存在任何可能构成利益冲突的商业或财务关系。
