《Journal of Biophotonics》：Ex Vivo Assessment of Keratinocytic Carcinomas Using a Fast Mid-Infrared Probe
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本文推荐一项利用快速中红外（midIR）探针结合衰减全反射（ATR）光纤传感器和量子级联激光器（QCL）技术，对莫氏手术中切除的新鲜皮肤组织进行离体（ex vivo）光谱分析的研究。该研究通过线性支持向量机（SVM）模型分析角质形成细胞癌（KC）与正常皮肤的光谱差异，在150名患者的数据集中实现了93%±5%的灵敏度和82%±6%的特异性（三次测试估计标准差）。该技术为皮肤癌的快速、无创诊断提供了新思路，有望降低活检数量（NNB），具有重要的临床转化潜力。
ABSTRACT
一项研究利用快速中红外光谱探针记录了在莫氏手术中从经活检证实的角质形成细胞癌（KC）患者身上切除的新鲜皮肤组织的红外（IR）光谱。研究建立了一个包含150名患者的IR光谱数据库，旨在检验能否在组织样本的表皮侧（外侧）区分KC与相邻的非恶性组织和正常皮肤。研究采用线性支持向量机（SVM）模型进行训练，以最小化过拟合，并预测光谱中每个步骤对分类决策的贡献。在平衡KC和非肿瘤样本误分类代价的条件下，对整个数据库进行三次测试（esd）的结果显示，该模型对KC的灵敏度达到93%±5%，特异性为82%±6%。此项初步研究的成功为未来探索在活体皮肤上区分黑色素瘤与良性黑素细胞病变及其他皮肤病变的可能性奠定了基础。本研究经Advarra机构审查委员会批准，批件号PRO00053468。
Abbreviations
研究涉及大量缩写，包括：基底细胞癌（BCC）、估计标准差（esd）、电子散射光谱（ESS）、傅里叶变换中红外光谱（FTIR）、红外（IR）、角质形成细胞癌（KC）、碲镉汞红外探测器（MCT）、中红外（midIR）、活检数量比（NNB）、非肿瘤组织（NT）、光学相干断层扫描（OCT）、量子级联激光器（QCL）、反射式共聚焦显微镜（RCM）、受试者操作特征（ROC）、鳞状细胞癌（SCC）、支持向量机（SVM）。
1 Introduction
中红外光谱学长期以来被认为具有区分癌组织与正常组织的能力。光纤系统可以扩展应用的空间范围，并将移动式衰减全反射（ATR）传感器与傅里叶变换红外光谱（FTIR）仪结合，允许对任何可以接触ATR晶体表面的物体（如皮肤）进行采样，并且已有皮肤癌相关研究。然而，由于FTIR系统具有移动光学部件和液氮冷却探测器，其在临床诊断实践中的应用有限。量子级联激光器（QCL）的出现，使得与光纤、波导和ATR传感器耦合，实现快速、简单的midIR探针成为可能。本研究采用基于Mizaikoff策略的探针系统，使用QCL光源照射PIR光纤环作为ATR传感器。该系统与用于凝聚相组织研究的FTIR标准（通常采用8或4 cm-1分辨率）有很大不同。本研究使用的midIR探针采用Block Engineering的双QCL可调谐（2-tuner）系统，其范围（1340–1860 cm-1）大大缩小，带宽（~1 cm-1）较窄，并且测试了使用增加的光谱间隔（10 cm-1）以提高探针速度。核心问题是，为了癌症诊断的速度，可以在多大程度上牺牲光谱信息？
本研究团队之前的工作表明，midIR探针的光谱决策与KC的H&E染色结果匹配准确率约为95%。当前研究建立了150名患者的IR探针光谱库，旨在检验能否在离体（ex vivo，即已切除但在外侧测量）组织样本的表皮侧区分KC与正常皮肤。这比在活体皮肤上记录光谱更近了一步。分析采用线性SVM模型训练数据，并预测每个光谱步骤对决策的贡献。本研究还开发了误差分析程序以解决过拟合问题，证明线性SVM模型的合理性，并为结果提供误差范围。KC的临床/视觉诊断通常具有挑战性，因为许多其他皮肤病变具有相似特征。本研究作为一个测试案例，旨在评估未来对黑色素瘤及其模拟良性病变以及其他皮肤状况进行区分研究的必要性。
角质形成细胞癌（KC，包括BCC和SCC）的发病率超过所有其他癌症，且呈上升趋势。虽然BCC的致死率相对较低，但每年仍有超过4400名患者死于SCC。疑似KC的标准处理流程是视觉检查后进行活检。大多数活检由皮肤科医生进行，但初级保健医生和其他临床医生也可能开具活检。活检的准确性通过活检数量比（NNB，总活检数除以检出的癌症数）来衡量。NNB值越低，通常意味着特异性越高。除了高灵敏度外，皮肤癌检测设备也需要高特异性。过度活检会带来成本、发病率以及患者心理困扰等问题。
2 Experimental and Methods
2.1 Study Design and Patients
本研究旨在对莫氏手术期间从经活检证实的KC患者身上切除的新鲜组织进行离体中红外光谱探测。所有入组患者均符合纳入标准。研究在俄亥俄州韦斯特维尔的皮肤外科中心进行。共招募150名患者，其中58.6%为男性，41.4%为女性，年龄范围50-97岁（平均77±12岁）。所有患者均为Fitzpatrick皮肤类型1或2。最终，光谱库包含96例非肿瘤样本和150例KC样本。所有组织在离体探测期间保持完整。
2.2 Mid-IR Probe
IR-Medtek探针采用衰减全反射红外光谱技术，通过接触皮肤的光纤环传感器进行检测。QCL光源（Block Engineering LaserTune）在1340–1870 cm-1范围内以10 cm-1为步长进行调谐，时间尺度约为1秒。红外脉冲通过光纤（约1米长的多晶AgCl:AgBr固溶体，即PIR 900/1000）传导至一次性光纤ATR双环传感器。当探针接触皮肤时，组织生物分子会吸收在光纤环表面几微米外传播的倏逝波，导致振动吸收损失。未被吸收的光返回至Vigo MCT探测器，信号由数字示波器采集，经专有程序处理得到吸收光谱。
2.3 Spectral Data Library
每个光谱对应组织接触约1分钟，并对每个光谱的10次扫描进行平均。最终光谱库由150例KC和96例非肿瘤病例的平均光谱构成，共246个“样本病例”。每个光谱包含1340–1870 cm-1范围内的54个数据点（10 cm-1间隔）。KC和非肿瘤组织的平均归一化光谱显示出明显的差异。光谱预处理包括基线校正和归一化，以校正探针接触组织时压力差异造成的光强变化。
2.4 Linear SVM Model of Spectral Library
研究最终采用线性SVM模型（MATLAB的“fitcsvm”函数）进行分析。输入预测变量为预处理后的IR光谱，响应变量为病理诊断结果。通过推导的“决策贡献谱”（Decision Contribution Spectrum）可以显示每个波数对癌症决策的平均贡献。为获得误差并解决过拟合问题，研究分析了随机N折分区（N=2,3,4,5,6,8,10）并进行20次重复迭代。通过绘制结果与1/N的关系图可以观察训练和测试的趋势。
3 Results and Discussion
线性SVM模型产生的决策贡献谱具有高度结构性，表明并非所有波数对决策的贡献均等。最重要的正贡献波数为1750, 1690, 1630, 1560, 1530, 1450, 1360 cm-1，最重要的负贡献波数为1730, 1650, 1590, 1500, 1410 cm-1。贡献值接近零的波数区域可能无需测量。
过拟合是选择机器学习模型时的最大问题。线性SVM模型过拟合程度最低。使用完整数据库和代价比为1.35进行训练时，受试者操作特征（ROC）曲线下面积达到0.962。通过N折分区分析表明，线性SVM模型的训练和测试结果具有较好的重叠性，表明其过拟合程度最小。
通过调整误分类KC的代价，可以改变KC的灵敏度和特异性。在平衡数据集（KC与非肿瘤样本比例为1.56）的情况下，经验发现代价比为1.35时，灵敏度和特异性几乎相等（均为约90%）。当使用三次测试标准差作为误差，并在病例基础上采用代价比为1.00时，探针区分KC与正常皮肤的能力表现为高灵敏度（93%±5%）和特异性（82%±6%）。更高的灵敏度（如95%）可以通过降低特异性来实现，但需谨慎，因为特异性降低会提高NNB。
4 Conclusions
本研究明确证明了IR Medtek探针在离体条件下区分表皮KC与正常皮肤（Burrow三角或未受累的邻近组织）的能力。线性SVM模型是获得良好训练结果且过拟合程度最小的最佳单一模型。随着未来患者数据的增加，测试性能有望进一步提升。
IR Medtek探针的中红外光谱可以与其他非侵入性技术（如OCT、RCM、皮肤镜、ESS）相结合，为医疗专业人员提供关于皮肤病变恶性潜能的客观信息。与FTIR仪器相比，该探针速度更快、操作更简单，具有在皮肤癌检测医疗实践中应用的潜力。
未来的工作需要：增加患者数量和测试中心、开展活体（in vivo）研究、将黑色素病变（恶性黑色素瘤和痣）以及各种非癌性皮肤状况纳入中红外光谱库。IR Medtek探针旨在为临床专业人员提供实时、客观的信息，帮助判断哪些皮肤病变需要活检，其易用、无创、便携、快速的特性有望显著减少不必要的活检或转诊。
Author Contributions
Casey博士和Siegle博士是IRB的主要研究者。Coe教授指导光谱学和数据分析。Hitchcock博士提供病理评估和医学观点。Bradley和Vazquez de Vasquez博士是IR Medtek LLC的研究科学家，负责数据记录、维护和分析。Cusick博士协助管理皮肤外科中心的运营。
Acknowledgments
感谢IR Medtek LLC的资助和支持，以及皮肤外科中心对研究的便利和支持。
Funding
本研究由IR Medtek LLC支持。
Ethics Statement
所有文件均获得Advarra机构审查委员会的批准。
Conflicts of Interest
Coe和Hitchcock是俄亥俄州立大学授权给IR Medtek LLC专利的共同发明人，拥有部分版税权益。Casey和Siegle博士是本研究的主要研究者，并持有公司股份。
Data Availability Statement
研究光谱库数据暂不共享。
