《Journal of Chromatography A》：Multi-Attribute Methods in Antibody-Drug Conjugate Characterization and Quality Control: Opportunities, Challenges, and Regulatory Outlook
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G4s-RHAU相互作用机制研究首次结合MD模拟、SEC和ITC方法，系统分析六种不同d-G4s与RHAU的构效关系，揭示结构多样性导致垂直/水平非典型结合模式差异，阐明Glu26静电作用关键性。
朱敏|朱龙宇|安露燕|王菊|乔俊琴|杨汉月|郑伟娟|连洪珍
中国南京大学化学与化学工程学院分析化学国家重点实验室及共享科研设施中心，仙林大道163号，南京210023
摘要
关于G-四链体（G4s）与富含鸟嘌呤（AU）的元件（RHAU）相互作用的研究促进了针对G4s的治疗性开发。尽管取得了这些进展，但二聚体G-四链体（d-G4s）与RHAU之间的相互作用相比单体结构仍研究较少。开发便捷且可视化的方法来阐明不同d-G4s结构与RHAU之间的相互作用机制，可以为结合模式提供新的见解，从而有助于设计针对d-G4s的分子工具。在本研究中，我们首次结合分子动力学（MD）模拟、尺寸排阻色谱（SEC）和等温滴定量热法（ITC）来研究d-G4s-RHAU相互作用的结构依赖性。分析了多种d-G4s结构，包括混合非平行型（d-24TTG）、分子内串联平行型（dAGRO100、GGA8）、互锁平行型（93del）和分子间堆叠平行型（T30695、T30177）。MD模拟显示，d-G4s-RHAU相互作用中的不同SEC保留行为主要受结合位点可及性、位点间空间阻碍以及结合自由能梯度的影响，这些趋势得到了ITC测定的亲和力的支持。此外，能量分解分析表明RHAU中的Glu26是一个对静电相互作用起关键作用的残基。将其突变为Arg26显著降低了结合自由能（-94.05 ± 0.41 kJ/mol），突显了其功能重要性。因此，这项工作表明MD模拟对于揭示实验现象的原因和理解色谱行为背后的机制是不可或缺的。这种综合策略不仅能够区分由结构多样性引起的相互作用模式，还能加速针对G4s的分子的筛选。
引言
G-四链体（G4s）是由富含鸟嘌呤的序列形成的非典型核酸二级结构[1]，在基因组调控区域（如端粒、癌基因启动子和mRNA非翻译区）中普遍存在，在其中发挥重要作用[[2]、[3]、[4]]。作为常见的多聚体，二聚体G4s（d-G4s）是开发选择性治疗药物[5,6]和功能性纳米材料的有希望的目标。阐明d-G4s的结构有助于设计用于基因表达调控的配体[7]，并增强其在DNA纳米技术中的应用，以实现靶向递送系统[8]。
与富含鸟嘌呤的元件（RHAU）肽相关的RNA解旋酶已被证明具有G4s解旋酶活性，能够结合并解开DNA和RNA中的G4s结构[9,10]。探索RHAU与d-G4s之间的相互作用可以揭示该肽如何选择性地识别并结合这些核酸结构。设计专门针对d-G4s的功能性蛋白质以调控与G4s相关的生物过程（如抑制蛋白质表达[11]），为疾病治疗提供了新的策略。此外，此类研究还可以为开发用于化学生物学研究的新型G4s配体提供结构基础和理论指导，例如监测和调控与G4s相关的生物过程[12,13]，以及开发针对G4s的药物[14]。例如，通过靶向癌基因启动子（如MYC、KRAS）中的G4s结构来应对具有耐药性的蛋白质，天然产物衍生的配体显示出显著的潜力[15]。
目前研究G4s-RHAU相互作用的方法主要包括圆二色光谱法进行结构表征[16,17]、X射线晶体学进行原子级复合体可视化[18,19]，以及荧光探针监测细胞中的G4s[20]等。我们的团队引入了尺寸排阻色谱（SEC）作为一种快速分析工具，用于研究不同构象的RHAU与G4s之间的相互作用[21]。虽然这些方法提供了有价值的结构信息或捕捉了集合平均动态特性，但它们通常缺乏对结合动态的时间分辨率。分子动力学（MD）模拟通过时间分辨的生物分子动力学建模，为结合机制提供了独特的见解[22,23]。
在本研究中，我们使用MD模拟了RHAU与d-G4s之间的相互作用，以阐明SEC中观察到的d-G4s保留行为背后的详细机制。我们的目标是阐明结合过程中的重要模式和能量贡献。通过结合实验结果和计算模拟，可以更全面地理解G4s-RHAU结合机制，从而为探索G4s的特定结构提供新的策略。此外，这种方法还可以为针对G4s的药物开发和生物技术应用提供更多选择。
模拟系统
模拟的系统
重点研究了六个d-G4s-RHAU系统：d-24TTG [24]、dAGRO100 [25]、GGA8 [26]、93del [27]、T30695 [28] 和 T30177 [29]，以及一个单体G4s-RHAU系统：24TTG [30]。除了使用Pymol 2.5软件[31]构建并借助3D-NuS辅助的d-24TTG [32]外，其他结构是从RCSB数据库[33]中获取的。这些结构的详细信息见表1。
分子对接
HDOCK的结果显示在图S2中。选择了代表性结构进行进一步分析。d-24TTG与RHAU之间的相互作用表现出两种不同的结合模式：垂直侧向结合和环连接区域的水平结合（图1a）。这些结合模式不同于G4s的典型结合模式，后者通常表现为堆叠或沟槽结合。这种特定的结合组合模式表明了混合二聚体相互作用的潜力。
结论
MD模拟显示，d-G4s的结构多样性导致其与RHAU的结合模式不同，这反映在它们的色谱保留行为上。例如，混合单体24TTG对RHAU没有结合效应，而d-24TTG与RHAU的结合较弱。这种差异归因于由TTA碱基连接的环区域内的G-四联体堆叠错位，导致了非经典的垂直结合模式。
CRediT作者贡献声明
朱敏：撰写——原始草稿、可视化、验证、方法学、研究、形式分析、数据整理。朱龙宇：方法学、研究。安露燕：方法学、研究。王菊：方法学、研究。乔俊琴：撰写——审阅与编辑、验证、资源获取、项目管理、资金申请、形式分析、概念化。杨汉月：资源、方法学、研究。郑伟娟：形式分析、概念化。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（编号：22304075、21577057、91643105、21874065和22176085）和国家重点研发计划（编号：2021YFF0600800）的支持。我们确认本文中的数值计算是在南京大学的高性能计算中心（HPCC）完成的。
