《Journal of Chromatography A》：Groundwater-adapted FMOC-LC-MS/MS for Glyphosate, Glufosinate and AMPA: EDTA-assisted preconditioning and application in Buenos Aires wells
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地下水环境中 glyphosate（GLY）、氨基甲基膦酸（AMPA）和 glufosinate（GLU）的 LC-MS/MS 分析方法优化。开发 SUBTE 工艺，通过酸化及 EDTA 处理消除二价阳离子干扰，较传统 BORAX 法回收率提升 26%，在 Ca2?-Mg2? 浓度高达 500 mg/L 的硬水中实现 0.003-0.02 μg/L 检测限，线性范围 0.5-20 μg/L（R2≥0.99），适用于南美潘帕斯平原地下水监测。
托马斯·麦克·洛林（Tomás Mac Loughlin）| 马科斯·纳瓦罗（Marcos Navarro）| 玛丽亚娜埃拉·拉莫斯（Marianela Ramos）| 达亚娜·德尔·阿西普雷特（Daiana Dell' Arciprete）| C. 费利佩·埃雷拉·尼尼奥（C. Felipe Herrera Ni?o）| F. 曼努埃尔·弗洛雷斯（F. Manuel Flores）| 莱蒂西亚·佩卢索（Leticia Peluso）
摘要
草甘膦（GLY）及其主要降解产物氨基甲基膦酸（AMPA），以及化学结构相似的膦酸类除草剂草胺膦（GLU），是广泛使用的农用化学品。由于与二价阳离子的络合作用以及受基质影响的离子化现象，这些物质在地下水中的可靠定量分析仍然具有挑战性。本研究开发并验证了一种适用于地下水的LC-MS/MS方法，该方法采用了FMOC衍生化技术，并使用同位素标记的草甘膦（GLY*）作为内标。新方法（SUBTE，源自SUBTERRANEAN项目）在过量EDTA存在下进行酸化处理，以破坏金属络合物，然后进行衍生化反应。该方法与传统的硼酸盐缓冲体系（BORAX）进行了对比测试。标准化校准曲线在0.5至20 μg·L?1范围内呈线性（R2 ≥ 0.99），且结果具有基质适应性。在真实地下水样品中的操作检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别为：GLY 0.003/0.01 μg·L?1，GLU 0.01/0.04 μg·L?1，AMPA 0.02/0.06 μg·L?1，满足精度要求（最低浓度下的相对标准偏差≤20%）。在具有不同电导率和Ca+2 + Mg+2含量的实际地下水样品中（n = 50），SUBTE方法的平均回收率约为96%，而BORAX方法的回收率约为70%，这表明该方法有效减轻了二价阳离子带来的干扰，并在硬水中表现出更好的稳定性。在采样时，没有任何样品中的分析物超过检测限，这与潘帕斯平原地区低流动性、富含钙的地质特征相符。因此，SUBTE方法为地下水中的草甘膦、氨基甲基膦酸和草胺膦的常规监测提供了一种经过验证、具有基质适应性的方法，确保了在各种水文地球化学条件下的可靠定量。
引言
草甘膦（GLY）是全球使用最广泛的非选择性除草剂之一，占全球农药消耗量的很大比例[1,2]。其主要环境降解产物氨基甲基膦酸（AMPA）也经常被检测到，因为两者具有相似的极性和环境持久性[3]。另一种具有类似分子结构和作用机制的膦酸类除草剂草胺膦（GLU），在多个作物系统中逐渐被视为草甘膦的潜在替代品[4,5]。由于这些高极性化合物对水生生态系统和饮用水源的潜在影响，对其进行了广泛的监测[1,6]。在集约化农业区，地下水尤其值得关注，因为扩散输入和地下传输可能导致低水平的长期暴露[7,8]。因此，可靠地测量这些高极性、低分子量的膦酸类物质在地下水中的含量仍然是分析工作的重点[3]。一项汇总了48项研究的全球性综述显示，多个国家的地下水中都检测到了草甘膦/氨基甲基膦酸的污染，某些情况下其浓度超过了欧洲规定的0.1 μg·L?1的限值；风险因素包括靠近施药区域、施药后降雨量大以及大孔土壤中的优先流动[8]。
在阿根廷，作为世界上除草剂使用量最大的国家之一，以草甘膦为基础的除草剂占据了市场主导地位，因此在集约化农业区的地下水暴露问题日益突出。早期的监测主要集中在地表水和集水区，同时强调了了解这些物质向含水层垂直传输的必要性，尤其是在免耕系统中[9]。后续的地下水调查显示，在科尔多瓦省约有16%的井中检测到了这些物质，浓度通常≤2 μg·L?1，这与浅层地下水位和当地的水文地质条件有关[10]。尽管如此，全国范围内的饮用水农药监测体系仍不完善且更新不及时；2010年代，为了应对公众关切，实验室常规监测项目得到了扩展，但监管名单中仍缺少许多常用农药[11,12]。鉴于阿根廷农村地区普遍依赖地下水作为饮用水来源，这一情况凸显了阿根廷农业区地下水暴露的环境现实性，以及需要开发针对地下水化学特性的灵敏、具有基质适应性的LC-MS/MS方法。
从分析角度来看，草甘膦/氨基甲基膦酸/草胺膦存在一些已知挑战：它们具有高极性，离子化过程可能受基质影响，且反相LC-MS/MS分析通常需要衍生化处理[13]。经典的碱性pH条件下FMOC-Cl柱前衍生化方法是LC-MS/MS测定的基础[14]。然而，与硬度阳离子的络合作用会降低反应产率或改变色谱/离子化行为，这一现象在关于草甘膦及相关膦酸类的色谱学和环境研究中已被多次观察到[15], [16], [17], [18]。许多已发表的方法是在溶剂或低硬度基质中优化的，随后直接应用于环境样品，但很少考虑地下水的特殊化学性质，这常常导致回收率降低和稳定性不佳[3]。为了解决硬水中的这些问题，一些作者建议在衍生化前进行酸化处理以破坏金属-配体络合物，使用惰性聚合物成分减少吸附损失，并使用同位素标记的内标来补偿残留变异性[2,13,19,20]。这些实用建议在最近的方法学综述和评论中得到了强调[1,3,13]，它们强调了在恢复碱性条件进行FMOC衍生化及后续反相LC-MS/MS分析之前进行解络合的重要性。
鉴于此，本研究开发了一种适用于地下水的特定方法，该方法可以防止或消除衍生化前的分析物-金属络合现象。该方法通过LC-MS/MS同时测定草甘膦、草胺膦和氨基甲基膦酸，并与最初为地表水优化的硼酸盐/FMOC方法进行了对比测试。其原理是尽量减少衍生化前的金属络合作用损失，并通过使用同位素标记的草甘膦（GLY*）作为内标来标准化定量结果。该方法在具有不同电导率和二价阳离子含量的实际地下水样品中进行了性能评估，并通过对照实验验证了在不同水文化学条件下的回收情况。
试剂和标准品
乙腈和甲醇（HPLC级）购自J.T. Baker（美国），农药残留级二氯甲烷购自U.V.E.（布宜诺斯艾利斯，阿根廷）。超纯水由Sartorius Arium系统（德国哥廷根）制备。盐酸（HCl）、四硼酸钠（Na2CO3）、碳酸钠（Na2CO3）、乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA）和乙酸铵（分析级）购自Merck Millipore（德国达姆施塔特）。草甘膦（GLY，纯度99%）的参考标准品也来自Merck Millipore。
同位素标记草甘膦（GLY*）的回收率
图1总结了在1-10 μg·L?1添加水平下，使用BORAX和SUBTE方法获得的同位素标记草甘膦（GLY*）的回收率对比情况，显示SUBTE方法的回收率和稳定性有所提高。
结论
本研究表明，专门为地下水分析优化的SUBTE方法有效减轻了二价阳离子的干扰，确保了FMOC衍生化过程的稳定性。标准化校准曲线在0.5-20 μg·L?1范围内呈线性，结果具有基质适应性，适用于常规分析。在真实地下水样品中的操作灵敏度表现为：GLY的检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别为0.003/0.01 μg·L?1，GLU为0.01/0.04 μg·L?1?1
CRediT作者贡献声明
托马斯·麦克·洛林（Tomás Mac Loughlin）：撰写初稿、资源准备、项目管理、实验设计、数据分析、概念构建。马科斯·纳瓦罗（Marcos Navarro）：方法学设计、实验设计、数据分析。玛丽亚娜埃拉·拉莫斯（Marianela Ramos）：方法学设计、实验设计、数据分析。达亚娜·德尔·阿西普雷特（Daiana Dell' Arciprete）：资源准备、实验设计、数据分析。C. 费利佩·埃雷拉·尼尼奥（C. Felipe Herrera Ni?o）：资源准备、方法学设计、概念构建。F. 曼努埃尔·弗洛雷斯（F. Manuel Flores）：撰写初稿、方法学设计、实验设计、数据分析。莱蒂西亚（Leticia）：
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了ANPCyT（PICT 2020-2665）、CONICET（PIP 2021-2452）和Williams基金（1180）的资助。我们感谢Clara Riglos在实验室中的专业技术支持。同时，我们也向达米安·马里诺（Damián Marino）博士表示最深的敬意，他是阿根廷环境污染研究领域的先驱人物。作为一位富有远见的科学家、敬业的导师和慷慨的同事，他的贡献对所有相关人员产生了深远的影响。
