《Journal of Drug Delivery Science and Technology》：Genistein-loaded mesenchymal stem cells (MSCs)-derived exosomes: A novel drug carrier for targeted osteosarcoma treatment via PPARγ pathway
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骨肉瘤治疗研究通过间充质干细胞来源外泌体负载大豆异黄酮苷元（genistein），证实其显著提高MG63细胞抑制活性（IC50=6.54 μg/mL，较游离组降低35.5%），激活PPARγ信号通路并增强细胞凋亡，同时在小鼠体内验证其高效抗癌与生物安全性。
顾志倩|张松苟|李国清|胡旭东|徐南健|王洋|阮健|马伟虎|陈洪
中国浙江省宁波市宁波大学健康科学中心，315211
摘要
骨肉瘤是一种极具侵袭性的骨癌，由于其对传统疗法具有抗性，因此在治疗上存在相当大的困难。本研究的目的是通过将染料木素封装到源自间充质干细胞（MSCs）的外泌体中，开发一种新型的基于染料木素的疗法，并评估其在体外对抗骨肉瘤的效果。通过透射电子显微镜（TEM）和纳米粒子追踪分析（NTA）研究了载有染料木素的外泌体（Exo-Gen）的物理化学特性。用Exo-Gen处理骨肉瘤细胞系MG63，并使用CCK-8实验、流式细胞术和Transwell实验评估其对细胞活力、细胞摄取和迁移的影响。Western blot实验用于检测PPARγ通路相关蛋白（PPARγ、PTEN、P21、Cyclin B1、Bcl-2和Survivin）的表达情况。RT-qPCR用于测定PPARγ和PTEN的mRNA表达水平。与游离染料木素（Free-Gen）相比，Exo-Gen在MG63细胞系中表现出更高的细胞摄取效率和细胞毒性，其半数抑制浓度（IC50）分别为10.18 μg/mL和6.54 μg/mL。Exo-Gen显著增强了骨肉瘤细胞中的PPARγ表达。染料木素是一种无毒的PPARγ激活剂，通过外泌体给药时能有效抑制骨肉瘤细胞的生长。此外，利用携带肿瘤的小鼠模型进行的体内研究证实了Exo-Gen的增强抗癌效果和生物相容性。这种方法显著改善了染料木素的分布和效果，使其成为未来癌症治疗的理想平台。
引言
最常见的起源于骨组织的恶性肿瘤是骨肉瘤，也称为骨癌，尤其在年轻人和青少年中较为常见。骨肉瘤是一种自发的间充质源性恶性肿瘤，其特征是肿瘤细胞产生类骨组织。该疾病以快速生长、强烈的局部侵袭性和早期肺转移为特点。目前骨肉瘤的标准治疗方法是截肢结合新辅助化疗。尽管外科技术和化疗方案有所进步，但五年生存率仍然较低，尤其是在转移或复发的情况下。遗憾的是，五年后仅有60%至70%的骨肉瘤患者存活。此外，尽管接受了治疗，骨肉瘤患者的复发率仍然很高。这可能是因为现有的骨肉瘤化疗方法效果不佳且选择性差，同时伴有许多不良反应。因此，迫切需要开发新型、定制化的药物，以增强杀伤肿瘤的效果并减少不良反应，从而延长患者的生命。
由于传统化疗药物（如多柔比星和顺铂）具有显著的系统性毒性、化疗耐药性和不良反应，因此需要开发疗效更高、安全性更好的新治疗策略。天然化合物因其多种生物活性和较低的毒性而在癌症治疗中受到广泛关注。其中，染料木素是一种从大豆中提取的异黄酮，已被证明具有强大的抗癌特性，如抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡和预防多种癌症（包括骨肉瘤）的转移。染料木素在极性有机溶剂（如乙醇、丙酮和二甲基亚砜）中的溶解度较高，但在水中的溶解度较低。这些因素限制了其临床应用。为了克服这些限制，需要开发新的药物递送技术，以提高药物的稳定性、靶向性和细胞摄取能力。现有研究表明，纳米化的染料木素能够抑制肿瘤形成，延长体内循环时间，并提高多种癌症模型中的治疗效果。
在过去几十年中，外泌体（EXOs）作为癌症治疗中递送化疗药物的方法显示出巨大潜力。大多数类型的细胞都会释放外泌体，这些细胞外囊泡的典型尺寸在30-150纳米之间。外泌体的基本功能是维持细胞正常代谢和促进细胞间通信，同时参与多种关键生物过程，实现细胞间物质的交换。
外泌体是一种天然存在的囊泡，已被广泛研究作为潜在的自然药物递送系统，因其天然的生物相容性、低免疫原性和靶向特定细胞类型的能力而备受关注。源自MSCs的外泌体能够高效地将RNA、蛋白质和小分子等药物输送到癌细胞中，尤其在肿瘤靶向方面表现优异。尽管如此，关于通过MSCs衍生的外泌体将染料木素输送到骨肉瘤细胞的具体机制仍有许多未知之处。
虽然研究发现染料木素可作为PPARγ的天然配体，触发PPARγ依赖的基因转录并调控PPARγ信号通路，但也有研究表明植物雌激素可能通过雌激素受体以外的核受体发挥作用。此外，高浓度的染料木素（>1 μmol/l）可能与PPARγ结合并抑制骨形成。PPARγ属于激素核受体超家族，是一种PPARs亚型，在脂质代谢、葡萄糖稳态、炎症和致癌过程中调控基因转录。其抗癌活性引起了广泛关注。
因此，本研究旨在开发源自MSCs的载有染料木素的外泌体（Exo-Gen），作为新型的生物相容性纳米平台用于骨肉瘤治疗。我们在体外评估了Exo-Gen对MG63骨肉瘤细胞的抗增殖、抗迁移和促凋亡作用，重点关注PPARγ介导的信号通路调节，并在携带肿瘤的小鼠体内验证了其抗肿瘤效果。这种综合方法结合了外泌体工程和天然化合物疗法，实现了肿瘤选择性染料木素递送，提高了治疗效果并减少了全身毒性，解决了骨肉瘤治疗中的关键问题。
材料
骨肉瘤MG63细胞（ATCC，美国）和小鼠骨髓MSCs（Cyagen Biosciences，中国）在含有10% FBS和1%抗生素的DMEM或MEM培养基（Thermo Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）中培养。用于生产外泌体的MSCs在含有1% MSCGS-sf和1% P/S的MSCM-sf培养基（ScienCell，美国）中生长。染料木素（≥98%，Sigma-Aldrich，美国）溶解在DMSO（Sigma-Aldrich，美国）中，并加入三乙胺（≥99%，Sigma-Aldrich，美国）以增加其溶解度。实验使用PBS（pH 7.4，Gibco，美国）进行。
源自MSCs的外泌体及其载有染料木素的外泌体的特性
使用透射电子显微镜（TEM）观察了加载染料木素前后外泌体的形态。图1A和1B显示了典型的外泌体结构。根据纳米粒子追踪分析（NTA），外泌体的尺寸范围较窄（图2A、2B），Free-Exo的峰值尺寸为99.7纳米。加载染料木素后，峰值直径增加到138.4纳米，具有统计学显著性（p < 0.05）。空白外泌体的尺寸更窄。
结论
本研究证明，源自间充质干细胞的外泌体是向骨肉瘤细胞递送天然异黄酮染料木素的有效载体。与Free-Gen相比，Exo-Gen在MG63骨肉瘤细胞中表现出优异的体外治疗效果，表现为更高的细胞毒性和更强的PPARγ信号通路激活作用。此外，Exo-Gen的抗肿瘤效果和生物安全性也得到了验证。
作者贡献声明
陈洪：撰写、审稿与编辑、验证、监督。王洋：撰写、审稿与编辑、数据分析、数据管理。徐南健：撰写、审稿与编辑、数据分析、数据管理。马伟虎：撰写、审稿与编辑、验证、监督、项目管理。阮健：撰写、审稿与编辑、数据分析。张松苟：撰写、方法学设计、实验研究。顾志倩：撰写、方法学设计、实验研究。利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
数据可用性
数据可应要求提供。
资助
本研究得到了宁波市自然科学基金（202003N4283）、浙江省卫生健康委员会医学健康科技项目（2020KY840）以及宁波市骨科、运动医学与康复临床研究中心（2024L004）的支持。
