《Advanced Science》：Fermented Lacticaseibacillus Paracasei Cultures Ameliorate Colitis by Modulating Microbiota-Derived Tryptophan Metabolism and Macrophage Polarization
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本研究发现，富含活菌（≥5×1010CFU g?1）与微生物代谢物的高密度固态发酵副干酪乳杆菌培养物（PYW）能通过重塑肠道菌群结构、富集色氨酸代谢产物吲哚-3-乳酸（ILA）和吲哚-3-乙酸（IAA），激活芳香烃受体（AhR）信号通路，并抑制TLR4/NF-κB/MAPK通路以促进巨噬细胞M2极化，从而显著缓解DSS诱导的小鼠结肠炎。该研究为开发靶向菌群-代谢-免疫轴的新型益生菌疗法提供了实验依据。
研究背景
炎症性肠病（IBD）是一种慢性复发性胃肠道炎症性疾病，其核心病理特征包括肠道屏障破坏、免疫失调和肠道菌群紊乱。当前治疗方法如抗肿瘤坏死因子-α（TNF-α）抗体和5-氨基水杨酸衍生物疗效有限，约40%患者出现原发性无应答，五年内复发率超过70%。研究表明，IBD患者肠道菌群结构发生显著改变，有益共生菌（如乳酸杆菌和双歧杆菌）丰度降低，而致病菌（如大肠杆菌和肠球菌）数量增加。这种菌群失调会破坏微生物代谢网络，导致短链脂肪酸（SCFAs）和色氨酸衍生芳香烃受体（AhR）配体（如吲哚-3-乳酸（ILA）和吲哚-3-乙酸（IAA））产生减少。色氨酸代谢通过微生物吲哚途径、宿主犬尿氨酸途径和血清素途径在维持肠道稳态中发挥核心作用。
PYW在缓解DSS诱导结肠炎中表现出优于热灭活后生元（SPYW）的疗效
通过建立DSS诱导的小鼠结肠炎模型，研究发现PYW和SPYW均能显著缓解结肠炎症状，包括体重减轻、疾病活动指数（DAI）升高和结肠缩短。组织病理学评估显示，PYW处理组结肠组织呈现接近正常的隐窝结构和显著减少的炎症浸润，其病理表现与正常对照组极为相似。定量分析进一步证实PYW的组织学评分显著低于SPYW组。血清生物标志物检测表明，PYW和SPYW处理均能显著降低诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、髓过氧化物酶（MPO）、TNF-α和白细胞介素（IL）-6水平，并提高IL-10浓度。值得注意的是，PYW在降低MPO、TNF-α和IL-1β方面效果优于SPYW，表明PYW在全面调节氧化应激和炎症反应方面具有更强能力。
足够活菌量对PYW抗结肠炎功效至关重要
为确定活菌在PYW中的作用，研究向SPYW中梯度添加活副干酪乳杆菌（SP1 [5×108CFU g?1]、SP10 [5×109CFU g?1]和SP100 [5×1010CFU g?1]）。低剂量补充组（SP1/SP10）在缓解结肠炎症状方面与SPYW无显著差异，而高剂量组（SP100）则重现了PYW的结肠保护作用，表现出相当疗效。组织病理学评分证实，PYW和SP100组组织损伤显著减轻。血清细胞因子分析显示PYW和SP100组IL-6和IL-1β水平显著降低，IL-10水平升高。这些发现表明，足够的活菌量（≥5×1010CFU g?1）对PYW的抗结肠炎功效至关重要，活菌可能与其发酵代谢物协同增强抗炎效果。
PYW在调节结肠炎小鼠肠道菌群结构方面优于SPYW
肠道菌群失衡是IBD的典型特征，表现为α多样性降低和结构破坏。本研究中，模型对照组（MC）的Sobs指数（α多样性）显著低于正常对照组（NC）。SPYW干预显著提高了Sobs指数，而PYW干预未引起显著增加，这可能与PYW中高活菌量引起的短暂生态扰动有关。基于主坐标分析的β多样性分析显示，PYW干预比SPYW引起肠道菌群整体结构更大程度改变。在门水平上，拟杆菌门、厚壁菌门、疣微菌门和变形菌门为各组优势菌门。DSS处理显著增加了MC组变形菌门丰度，而PYW和SPYW均能显著抑制这一增加。在属水平上，DSS显著降低了有益菌属（如norank_f_Muribaculaceae和副干酪乳杆菌）丰度。PYW干预显著增加了norank_f_Muribaculaceae和副干酪乳杆菌丰度，而SPYW未能改善这些菌属。此外，PYW还显著降低了Parasutterella和肠球菌相对丰度。总结而言，PYW在调节DSS诱导结肠炎小鼠肠道菌群组成方面效果显著优于SPYW。
PYW调节结肠炎小鼠肠道菌群衍生色氨酸代谢网络
通过扫描电镜评估PYW与未发酵麸皮（KZ）的结构变化，发现KZ呈现致密形态，而PYW显示特征性多孔结构。成分分析显示，与KZ相比，PYW中不溶性膳食纤维水平显著降低，可溶性膳食纤维和黄酮类化合物水平显著升高。此外，PYW表现出优于KZ的DPPH和ABTS+自由基清除能力，表明发酵过程中微生物释放了抗氧化化合物。非靶向代谢组学分析发现，与KZ相比，PYW中1,679种代谢物上调，1,205种下调。主成分分析（PCA）显示发酵后代谢谱发生显著变化。特别值得注意的是，色氨酸衍生物（如ILA）和黄酮类化合物（如香蜂草苷）在PYW中富集。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析强调色氨酸代谢发生显著改变。热图进一步证实PYW中关键色氨酸代谢物（ILA、犬尿喹啉酸、3-吲?丙烯酸）和黄酮类化合物（香蜂草苷、6-C-β-吡喃葡萄糖基-8-C-α-阿拉伯吡喃芹菜素、6-葡萄糖基原花青素B2和皂草苷）水平升高。
基于这些发现，研究假设PYW中的活菌和代谢物可改善结肠炎小鼠肠道微生物代谢失调。通过肠道内容物非靶向代谢组学分析验证该假设，PCA确认各组代谢物聚类明显。火山图识别出NC和MC组间1,556种差异丰度代谢物，而PYW干预引起1,164种代谢物改变。KEGG通路富集分析显示PYW组色氨酸代谢、苯丙烷生物合成和酪氨酸代谢通路显著调节。通路特异性分析表明，在吲哚途径中，PYW显著增加吲哚、IAA、ILA和吲哚-3-乙醛水平。在血清素途径中，PYW提高5-羟色氨酸和5-羟基吲哚乙酸水平，同时降低5-羟基吲哚乙醛水平。在犬尿氨酸途径中，PYW增强向L-甲酰大尿氨酸和3-羟基邻氨基苯甲酸的转化。此外，粪便ILA（59 ng/只小鼠）和IAA（14 ng/只小鼠）浓度显著超过每日给药剂量（分别为0.4 ng和0.3 ng/只小鼠），确认主要由肠道菌群从头合成。
PYW通过激活AhR信号通路缓解结肠炎
近期文献表明，色氨酸代谢物如ILA和IAA作为关键AhR激动剂，通过激活AhR通路发挥抗炎作用。因此研究假设PYW通过AhR信号缓解肠道炎症。结肠组织样本转录组分析显示MC和PYW组间基因表达存在显著差异，在|log2折叠变化（FC）| > 1和调整p值（q）< 0.05阈值下识别出1,610个差异表达基因（DEGs）—PYW干预上调611个、下调990个。KEGG通路分析显示PYW组炎症相关通路（如细胞因子-细胞因子受体相互作用、IL-17信号和TNF信号通路）显著调节。具体而言，与MC组相比，PYW上调AhR相关（AhR和Cyp1a1）和屏障相关基因（Muc2、Reg3b、Cdh1、Cldn、B3gnt7和zbp1），同时下调促炎介质（Cxcl1、Cxcl2、Cxcl3、Cxcl5、Ccl2、Ccl7、Il1b、Il6、Ptgs2和Csf3）。验证实验证实这些转录组分析结果：qPCR确认AhR和Cyp1a1 mRNA表达显著增加。
转录组分析提示肠道屏障功能改善。通过组织化学和免疫荧光染色验证这一发现，过碘酸-雪夫（PAS）染色显示PYW处理组杯状细胞数量显著增加、黏蛋白分泌增强，表明化学屏障恢复。此外，紧密连接蛋白免疫荧光染色清晰显示PYW组ZO-1、Claudin-1和Occludin荧光信号显著强于MC组，确认这些关键连接成分上调。蛋白质印迹分析进一步量化这些发现，条带强度定量分析一致显示PYW组ZO-1、Claudin-1和Occludin相对蛋白表达显著高于MC组，为PYW治疗后肠道屏障完整性增强提供蛋白水平额外证据。此外，qPCR显示Cxcl1、Cxcl2、Cxcl3和Ccl2显著抑制，与上述血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平降低一致。为确认AhR通路依赖性，小鼠在PYW给药前用AhR拮抗剂CH223191预处理。CH223191预处理显著减弱PYW治疗效果，表现为体重恢复减少、DAI评分增加和结肠缩短改善减弱。分子分析进一步显示拮抗剂处理组结肠AhR、Cyp1a1、Muc2、Zo1、claudin-1和occludin mRNA表达水平显著降低，同时Il6和IL1b水平升高。这些数据共同证明PYW通过激活AhR信号通路增强肠道屏障功能和抑制炎症缓解结肠炎。
PYW通过提升肠道ILA和IAA水平缓解DSS诱导结肠炎
为阐明肠道菌群在PYW抗炎功效中不可或缺的作用，在干预前进行抗生素介导的菌群耗竭。结果显示，接受PYW的菌群耗竭小鼠（PA组）在病理表型（包括体重减轻、DAI评分和结肠缩短）方面与MC小鼠相比无显著改善，表明PYW功效依赖于完整肠道菌群。通过粪菌移植（FMT）进一步验证显示，接受PYW处理供体移植的结肠炎小鼠（PFMT组）与接受正常供体移植小鼠（NFMT组）相比体重减轻、便血、腹泻和结肠缩短显著减轻。PFMT处理显著改善DSS诱导的结肠损伤，苏木精-伊红（H&E）染色显示隐窝结构保留、炎症细胞浸润减少，PAS染色显示Muc2阳性区域显著增加。这些形态学改善通过显著降低的组织病理学评分和更大Muc2阳性区域得到确认。在分子水平上，PFMT上调屏障相关（Muc2、Zo1、claudin1和occludin）和AhR通路（AhR和Cyp1a1）基因，并抑制促炎细胞因子IL-6和IL-1β。
靶向代谢组学分析确认PFMT小鼠结肠ILA和IAA水平升高。外源性补充ILA或IAA独立重现治疗效果：减少体重减轻、降低DAI评分和改善结肠缩短。比较组织学显示MC组遭受严重黏膜侵蚀、炎症浸润和结构破坏，ILA和IAA补充组均显示显著组织修复，隐窝结构良好恢复、炎症反应显著减弱。PAS染色确认两种代谢物处理均显著增强Muc2分泌。这种恢复与AhR信号通路激活相关，表现为AhR和Cyp1a1显著上调，同时炎症显著抑制，促炎细胞因子IL-6和IL-1β表达下调。这些发现共同证明PYW通过富集肠道菌群衍生ILA和IAA缓解结肠炎。
ILA/IAA通过抑制TLR4/NF-κB/MAPK通路调节巨噬细胞极化
巨噬细胞在IBD发病机制中的关键作用已明确，调节其极化表型是缓解肠道炎症的有前景治疗策略。本研究中，PYW或其微生物代谢物ILA或IAA干预均显著上调结肠组织M2巨噬细胞标志物（CD206和Arg1）表达，同时下调M1标志物（CD86和iNos）。为阐明潜在机制，建立LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型。剂量反应实验确认ILA和IAA在浓度高达50 μM时保持>90%细胞活力（细胞毒性<10%）。50 μM ILA或IAA处理显著抑制一氧化氮产生。免疫荧光和qPCR分析进一步证明CD86表达降低同时CD206水平升高，表明向抗炎M2巨噬细胞表型转换。鉴于TLR4/NF-κB和MAPK通路在LPS驱动巨噬细胞活化中的核心作用，后续蛋白分析显示ILA或IAA处理显著下调TLR4表达、抑制NF-κB p65亚基磷酸化、增加p-IκBα水平并降低p38 MAPK磷酸化（P-p38/p38比率）。这些发现表明ILA和IAA通过抑制TLR4/NF-κB/MAPK信号轴调节巨噬细胞极化，从而促进抗炎M2表型。
