纳米颗粒递送单磷酸腺苷增强5-氧脯氨酸酶活性以缓解心力衰竭中的氧化应激

《Advanced Therapeutics》：Nanoparticle-Mediated Delivery of Adenosine 5′-Monophosphate Enhances 5-Oxoprolinase Activity to Mitigate Oxidative Stress in Heart Failure

本文报道了一种整合高通量筛选与先进纳米载体技术的创新策略，旨在通过激活5-氧脯氨酸酶（OPLAH）来治疗心力衰竭（HF）相关的氧化应激。研究团队从FDA批准化合物库中筛选出单磷酸腺苷（AMP）作为新型OPLAH激活剂，并开发了精胺修饰的乙酰化葡聚糖纳米颗粒（AcDXSp-NPs）以实现AMP的高效细胞内递送。该纳米递送系统展现出高包封率（>70%）和pH响应性释放特性。细胞实验证实，负载AMP的纳米颗粒能显著增强OPLAH活性，使同位素标记的13C5-5-氧脯氨酸转化为13C5-谷氨酸的产量增加超过50%。这项研究为针对氧化应激相关疾病（尤其是心力衰竭）的治疗提供了新思路。

　　

重组OPLAH的生产与表征

为系统筛选OPLAH激活剂，研究团队首先建立了蛋白生产和表征流程。在HEK293A细胞中成功表达了带His标签的重组人5-氧脯氨酸酶（rOPLAH）。蛋白质印迹分析证实了rOPLAH在约138.3 kDa处的表达。通过镍亲和层析纯化后，获得了高纯度的蛋白制备物，密度测定分析显示rOPLAH约占蛋白总量的69.2%。酶活性验证实验表明，纯化的rOPLAH在ATP存在下具有强烈的酶活性，能将5-氧脯氨酸（5OP）转化为谷氨酸（Glu），120分钟后底物转化率达到96.4%，且该过程严格依赖ATP。

高通量OPLAH检测方法的开发与验证

研究团队开发了一种基于ADP-Glo技术的发光法ATP酶偶联系统，用于在1536孔板格式中评估OPLAH活性。该检测方法在线性范围、信号背景比（约3）和Z‘因子（0.7）方面均表现出优异性能，符合高通量筛选（HTS）的要求。使用包含262种化合物的稳健性集合进行测试，结果显示检测特异性高，干扰最小，证实该系统适用于大规模化合物库筛选。

筛选Prestwick化合物库鉴定AMP为OPLAH激活剂

利用优化的检测方法筛选Prestwick化合物库（包含1,280种FDA批准化合物），鉴定出单磷酸腺苷（AMP）为OPLAH的有效激活剂，可使酶活性增加约55%。剂量反应分析证实了AMP对OPLAH活性的浓度依赖性增强作用，最低有效剂量为5 μM，最大激活在40 μM达到。反筛选实验排除了AMP对检测系统的干扰可能性。热位移分析（TSA）进一步验证了AMP与OPLAH的直接结合，显示剂量依赖性的蛋白稳定性增加，最高可使熔解温度（ΔTm）增加8.5°C。

纳米颗粒递送系统的整合

为解决AMP的细胞膜通透性差问题，研究团队设计了负载AMP的乙酰化葡聚糖精胺修饰纳米颗粒（AMP@AcDXSp NPs）。该递送系统采用pH敏感的乙酰化葡聚糖核心，确保AMP在接触到细胞内微环境酸化时释放。精胺修饰通过静电相互作用促进细胞摄取。这种刺激响应性纳米载体设计实现了亚细胞靶向和可控释放。

负载AMP纳米颗粒的理化表征和生物学评价

尺寸分布和形态：动态光散射（DLS）测量显示，空载和AMP负载的AcDXSp NPs的平均流体动力学直径分别为226.6 ± 6.8 nm和219.7 ± 26.4 nm，多分散指数（PDI）值极低（0.050 ± 0.016和0.105 ± 0.037），表明颗粒群体高度均一。透射电镜（TEM）证实了颗粒的球形形态和均匀尺寸分布。

表面电荷和形态分析：Zeta电位研究表明，空载和AMP负载的NPs均带有强正电荷（分别为+38.2 ± 1.7 mV和+37.1 ± 4.0 mV），有利于与带负电的细胞膜相互作用。

细胞摄取研究

用Alexa Fluor 488标记的AMP@AcDXSp NPs处理HeLa细胞，流式细胞术分析显示时间依赖性的纳米颗粒内化。1小时细胞内化率为12.7%，3小时增至39.5%，6小时达到66.2%。统计分析表明6小时的内化率显著高于早期时间点，证实了精胺修饰增强细胞摄取的效果。

生物相容性评估

通过CellTiter-Glo发光细胞活力测定法评估纳米颗粒的细胞毒性。HeLa细胞用不同浓度的AcDXSp NPs和AMP@AcDXSp NPs（25-200 μg mL^-1）处理12小时后，细胞活力均保持在90%以上，显著超过ISO 10993-5规定的无毒材料阈值（70%），证实了纳米颗粒的高度生物相容性。

纳米颗粒介导的AMP递送增强OPLAH活性

高效液相色谱（HPLC）分析显示包封效率为72.32%，相当于每毫克AcDXSp NPs负载2.54 μg AMP。在细胞实验中，通过测量HeLa细胞中¹³C₅-谷氨酸（¹³C₅-Glu）的合成来评估生物效能。结果表明，负载AMP的纳米颗粒能显著增加谷氨酸合成。在10 mM ¹³C₅-5OP条件下，谷氨酸浓度在50 μg mL^-1NPs处理下增加了82%。在5 mM ¹³C₅-5OP条件下，50和100 μg mL^-1NPs浓度均能显著激活OPLAH，分别增加67%和71%的谷氨酸产量。最佳OPLAH激活发生在50-100 μg mL^-1NPs浓度范围内。

靶向酶激活的背景与优势

与传统抗氧化治疗相比，增强OPLAH活性提供了针对心力衰竭中特定失调通路的治疗策略。通过增加OPLAH活性，可促进谷氨酸生产，这是谷胱甘肽（GSH）合成的关键前体，从而增强细胞的内源性抗氧化防御能力。将AMP封装在AcDXSp纳米颗粒中克服了其固有的通透性限制，确保了稳定有效的细胞内递送。

结论

本研究证实AMP能与OPLAH结合，增强5-氧脯氨酸向谷氨酸的转化。通过使用AcDXSp纳米颗粒，有效克服了细胞通透性障碍，实现AMP的细胞内递送，从而增强OPLAH活性并促进5-氧脯氨酸的解毒。这种靶向酶激活策略通过增强内源性抗氧化防御和提高细胞对氧化损伤的抵抗力，为治疗以氧化应激为特征的疾病（如心力衰竭）提供了重要的治疗潜力。