ZmRLR1基因通过调控抗坏血酸和生长素稳态介导玉米抗根倒伏性的自然变异机制

《Advanced Science》：Natural Variations of ZmRLR1 Mediate the Root Lodging Resistance of Maize by Regulating Root Ascorbate and Auxin Homeostasis

本研究鉴定了一个玉米根系特异性表达基因ZmRLR1，发现其通过调节抗坏血酸（AsA）含量和网格蛋白介导的内吞作用（CME）途径影响生长素（auxin）稳态，进而调控侧根发育。过表达ZmRLR1能显著增加根体积和抗拉强度，其启动子自然变异与田间抗倒伏性显著相关。该研究为玉米抗根倒伏育种提供了新靶点和理论依据。

　　

2.1 ZmRLR1正向调控玉米根系大小和抗根倒伏能力

通过分析玉米不同组织的转录组数据，研究人员发现了一个在根系中特异性高表达的基因Zm00001d021017。该基因在根系中表达量显著高于其他组织，并且定位在先前报道的与根系构型相关的基因组区域。研究人员构建了该基因的过表达转基因玉米株系，发现尽管过表达并不影响玉米的株高、生育期和籽粒性状，但却显著增加了根际土壤重量、地上50厘米处茎节的抗拉力、总根长和根体积。为了进一步验证该基因的功能，研究人员从玉米EMS诱变数据库中获得了两个ZmRLR1的EMS突变体（Zmrlr1_ems#1和Zmrlr1_ems#2），并利用CRISPR/Cas9技术构建了基因敲除突变体（Zmrlr1）。与野生型相比，这些突变体的根际土壤重量、茎节抗拉力、总根长、根体积和根鲜重均显著降低。在北京和海南两地的田间试验中，这些表型差异得到了重复验证。因此，该基因被命名为Root Lodging Resistance 1(ZmRLR1)，证实其正向调控玉米的根系大小和抗根倒伏能力。

2.2 ZmRLR1启动子的自然变异影响玉米的抗根倒伏性

2022年7月26日，北京顺义农业试验站遭遇暴雨，导致大面积玉米倒伏。研究人员对122份玉米自交系的倒伏程度进行了调查，并根据茎秆与地面的夹角将倒伏分为六个等级。相关性分析发现，总根长与倒伏指数呈显著正相关。随后，对这些自交系的ZmRLR1启动子（ATG上游2000 bp）和编码区进行了重测序。候选基因关联分析表明，启动子区的SNP-921和InDel-197与倒伏指数显著相关，分别解释了6.0%和6.6%的表型变异。根据这两个变异位点，自交系被分为三种单倍型（Hap1, Hap2, Hap3）。与Hap2和Hap3相比，Hap1单倍型的自交系具有更长的总根长、更强的抗倒伏能力以及更高的ZmRLR1mRNA丰度。这表明ZmRLR1启动子的自然变异是导致玉米抗根倒伏性差异的重要原因之一。

2.3 ZmRLR1调控玉米的侧根发育

为了探究ZmRLR1影响抗倒伏性的细胞学基础，研究人员通过原位杂交分析了其表达模式。结果显示，ZmRLR1在侧根、萌发中的侧根和初生根尖中均有表达。在培养3天的玉米幼苗中，过表达ZmRLR1显著增加了种子根中侧根原基的数量，而Zmrlr1_ems和Zmrlr1突变体中的侧根原基数量则显著减少。在水培培养7天的幼苗中，过表达株系的侧根长度、侧根密度和总根长均显著高于野生型，而突变体则显著低于野生型。这些结果说明ZmRLR1通过影响侧根的起始和发育来调控玉米的根系构型。

2.4 ZmRLR1影响玉米根系中的抗坏血酸（AsA）稳态

ZmRLR1蛋白含有一个DOMON结构域，属于质膜b型细胞色素家族。拟南芥中的同源蛋白AtAIR12参与细胞外氧化还原过程，并能被抗坏血酸（AsA）完全还原。研究人员检测了不同遗传材料根系中的AsA和H₂O₂含量，发现过表达ZmRLR1显著提高了根系中的AsA含量，而功能缺失突变则导致AsA含量下降和H₂O₂含量升高。外源施加25 μmol L^?1的AsA能够有效回补Zmrlr1_ems和Zmrlr1突变体在侧根密度和总根长方面的缺陷，表明AsA在ZmRLR1介导的侧根发育中起着关键作用。

2.5 ZmRLR1的功能与AtAIR12存在差异

亚细胞定位显示，与AtAIR12类似，ZmRLR1也定位于质膜和内质网。然而，两者对生长素的响应模式不同：外源施加活性生长素类似物1-NAA能在4小时内快速诱导ZmRLR1的表达，随后逐渐下降，而AtAIR12在拟南芥中受1-NAA持续诱导。此外，在拟南芥Atair12突变体中过表达ZmRLR1，只能回补其侧根数量的减少，但不能回补其初生根变短的表型。这些结果表明ZmRLR1与AtAIR12的功能并不完全一致。

2.6 ZmRLR1增强ZmAP2 σ亚基与ZmCHC2之间的相互作用

为了探索ZmRLR1除AsA稳态外是否还通过其他分子途径影响侧根发育，研究人员利用Pull-down结合液质联用（LC-MS）技术，以玉米根系膜蛋白为材料，寻找与ZmRLR1互作的蛋白。在39个候选互作蛋白中，网格蛋白重链ZmCHC2和AP2复合体的σ亚基引起了研究人员的注意，因为它们都是网格蛋白介导的内吞作用（CME）的关键组分。通过分裂泛素膜酵母双杂交、萤火虫荧光素酶互补成像、双分子荧光互补（BiFC）和免疫共沉淀（Co-IP）实验，证实了ZmRLR1与ZmAP2 σ亚基、ZmRLR1与ZmCHC2、以及ZmAP2 σ亚基与ZmCHC2之间均存在相互作用。进一步实验发现，共表达ZmRLR1能显著增强ZmAP2 σ亚基与ZmCHC2之间的荧光素酶活性，而共表达GFP则无此效果。这表明ZmRLR1是CME的一个新组分，并能促进ZmAP2 σ亚基与ZmCHC2的互作。

2.7 Zmrlr1_ems和Zmrlr1突变体内吞作用存在缺陷

为了验证ZmRLR1是否参与CME，研究人员利用内吞示踪染料FM4-64检测了内吞速率。在标记40分钟和70分钟后，野生型根细胞中出现FM4-64标记的荧光斑点的比例显著高于Zmrlr1_ems和Zmrlr1突变体。在使用真菌毒素布雷菲德菌素A（BFA）抑制内吞循环后，突变体中FM4-64标记的BFA小体的大小比野生型减少了约55%-60%。此外，研究人员还获得了ZmCHC2的EMS突变体，发现其侧根长度和密度显著降低。将Zmrlr1_ems与Zmchc2_ems杂交，双突变体的侧根表型与单突变体相似，表明ZmRLR1和ZmCHC2在调控玉米侧根发育中处于同一遗传通路。这些结果共同证明ZmRLR1对于内吞运输至关重要。

2.8 ZmRLR1介导玉米根系中的生长素稳态

通过对野生型、Zmrlr1突变体和ZmRLR1过表达株系根系进行转录组测序分析，发现突变体中差异表达基因显著富集在激素代谢过程、激素生物合成过程等通路，而过表达株系中差异表达基因则显著富集在生长素生物合成过程（GO:0009851）和生长素代谢过程（GO:0009850）。将生长素响应报告基因ZmDR5::RFP导入Zmrlr1_ems突变体后，发现其侧根和根冠中的RFP信号强度显著低于野生型。进一步检测表明，Zmrlr1突变体根系中的游离IAA、色氨酸（Trp）和IAA-葡萄糖（IAA-glc）结合物的含量均显著降低。外源施加25 μM AsA处理5天后，突变体中IAA、Trp和IAA-glc的含量可恢复到野生型水平。这些结果说明ZmRLR1通过影响生长素稳态来调控根系发育。

2.9 Zmrlr1_ems突变体中ZmPIN1a-YFP的定位发生改变

PIN1蛋白是介导生长素极性运输的关键蛋白，其内吞和循环主要依赖于CME途径。研究人员将ZmPIN1a::YFP报告基因导入Zmrlr1_ems突变体，观察PIN1a的定位变化。在野生型玉米的初生根中，YFP信号主要集中在中性鞘；而在Zmrlr1_ems突变体中，YFP信号则变得弥散。在萌发的侧根中，野生型根冠处清晰的YFP信号在突变体中几乎消失。这表明ZmRLR1通过调控内吞作用影响了PIN1a的蛋白定位，进而改变了生长素的分布。

救援实验揭示AsA和生长素的协同作用

为了验证生长素和AsA在ZmRLR1介导的侧根发育中的作用，研究人员尝试通过外源施加1-NAA和AsA来回补Zmrlr1_ems的表型缺陷。结果发现，单独施加25 μmol L^?1AsA或10 μmol L^?1AsA能不同程度地缓解突变体的侧根密度和总根长缺陷。单独施加0.01 μmol L^?11-NAA能促进野生型的侧根形成但抑制其总根长，但对突变体无显著影响，说明Zmrlr1_ems对外源IAA的敏感性降低。然而，同时施加10 μmol L^?1AsA和0.01 μmol L^?11-NAA能有效回补Zmrlr1_ems的总根长缺陷。这表明AsA和生长素在ZmRLR1调控的侧根发育中具有协同作用。

总结

本研究鉴定了一个玉米根系特异性表达的基因ZmRLR1。该基因作为质膜b型细胞色素家族成员，不仅影响根系中的AsA水平，还作为CME的新组分，通过增强ZmAP2 σ亚基与ZmCHC2的互作来调控内吞作用，进而影响生长素稳态和PIN1a蛋白的定位。遗传和生理实验证明，ZmRLR1通过协同调控AsA和生长素稳态，共同促进玉米侧根发育，最终增强其抗根倒伏能力。该研究为理解玉米抗倒伏的分子机制提供了新见解，并为玉米抗倒伏育种提供了有价值的基因资源。