精准工程化银单原子碳点纳米酶用于急性肾损伤的诊疗一体化管理

《Advanced Science》：Precision-Engineered Silver Single-Atom Carbon Dot Nanozymes for Theranostic Management of Acute Kidney Injury

本文报道了一种新型线粒体靶向银单原子碳点纳米酶（T-AgSA-CDs），该纳米酶通过模拟超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）的双重活性，高效清除活性氧（ROS），并在顺铂诱导的急性肾损伤（AKI）模型中展现出卓越的治疗效果。其固有的荧光特性实现了生物分布和肾脏积累的无创实时成像，为ROS相关疾病的诊疗一体化（Theranostic）提供了创新平台。

　　

1 引言

急性肾损伤（AKI）是一种以肾功能急剧恶化和高死亡率为特征的临床综合征，其关键病理特征之一是活性氧（ROS）的过度产生。ROS在正常细胞信号传导中必不可少，但过量积累会导致氧化应激，引起DNA损伤、蛋白质变性和脂质过氧化，最终诱导细胞凋亡和脏器功能中断。尽管AKI发病率和死亡率高，但能够直接有效干预氧化应激的治疗策略仍面临重大挑战，亟需新型抗氧化剂。纳米酶是一类具有类酶活性的纳米材料，与天然酶相比，其更稳定、成本更低且催化活性可调。其中，模拟超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）等关键抗氧化酶的纳米酶，在清除超氧阴离子（O₂•^?）和过氧化氢（H₂O₂）方面展现出巨大潜力。然而，开发在生理条件下具有高效、多功能和生物安全性的抗氧化纳米酶仍是一项挑战。银（Ag）因其显著的抗菌和催化性能而被广泛研究，但其在抗氧化纳米酶中的应用较少，主要受限于Ag⁺离子诱导的毒性和颗粒不稳定性。碳点（CDs）因其优异的水分散性、低毒性和丰富的表面官能团，成为稳定金属簇的理想平台。本研究报道了一种新型抗氧化纳米酶——碳点负载的银单原子纳米酶（Ag_SA-CDs），通过将银以单原子和亚纳米簇状态锚定在碳点基质上，实现了优异的SOD和GPx模拟活性，为AKI的诊疗管理提供了新策略。

2 结果与讨论

2.1 Ag_SA-CDs/N-CDs纳米酶的设计与表征

通过一步水热法合成氮掺杂碳点（N-CDs），并采用改进的两步法掺入银（Ag），得到Ag_SA-CDs。透射电子显微镜（TEM）显示N-CDs和Ag_SA-CDs呈均匀球形分布，平均直径分别为7.07 ± 1.63 nm和8.49 ± 1.71 nm。高角度环形暗场扫描透射电子显微镜（Ac-HAADF-STEM）证实Ag不仅以纳米簇形式存在，还以原子分散状态存在。X射线衍射（XRD）图谱显示Ag_SA-CDs在24°附近出现典型无定形碳的宽衍射峰，并出现了金属银的弱衍射峰，表明银成功锚定。紫外-可见光谱和荧光光谱表征显示，Ag_SA-CDs在410 nm处出现银的表面等离子体共振吸收峰，在560 nm处出现n-π*跃迁吸收峰。Ag掺杂增强了荧光强度，且Ag_SA-CDs在生理至酸性条件下具有优异的光学稳定性。傅里叶变换红外光谱（FTIR）和X射线光电子能谱（XPS）分析证实了Ag_SA-CDs表面存在丰富的含氧和含氮官能团，并成功掺入银。通过碳二亚胺交联反应将三苯基膦（T）功能化到Ag_SA-CDs表面，得到T-Ag_SA-CDs，其表现出改善的稳定性和细胞内化效率。

2.2 Ag_SA-CDs的结构与化学表征

X射线吸收光谱（XAS）分析，包括X射线吸收近边结构（XANES）和扩展X射线吸收精细结构（EXAFS），用于研究Ag_SA-CDs中单个Ag原子的局部化学环境和电子态。XANES谱显示Ag_SA-CDs的吸收边能量介于Ag箔和Ag₂O之间，表明Ag存在部分氧化的价态。EXAFS分析表明Ag原子主要与N或C原子配位，并形成Ag-Ag键，证实了单原子Ag和簇状Ag的存在。这些结果与XPS数据一致，表明Ag_SA-CDs由高度石墨化结构中的原子分散Ag⁰组成，与N和C紧密配位，从而具有优异的催化性能。

2.3 N-CDs/Ag_SA-CDs纳米酶的类酶特性

通过定量测量评估了N-CDs和Ag_SA-CDs的SOD-like和GPx-like活性。在SOD-like活性测试中，Ag_SA-CDs在8 μg/mL浓度下对O₂•^?的抑制率可达98%，其最大SOD-like活性为11,814 U/mg，是N-CDs（2,763 U/mg）的4.3倍，优于天然牛Cu/Zn-SOD及许多无机和CDs基SOD纳米酶。在GPx-like活性测试中，Ag_SA-CDs能有效催化H₂O₂的还原，而N-CDs几乎无此活性。动力学研究显示，Ag_SA-CDs对H₂O₂的Km值为0.091 mM，Vmax为12.02 μM/min。此外，ABTS•⁺和DPPH•自由基清除实验表明Ag_SA-CDs具有广谱抗氧化活性。电子自旋共振（ESR）光谱进一步证实了Ag_SA-CDs具有更强的O₂•^?清除能力。

2.4 机理与能量学的实验与理论分析

采用原位漫反射红外傅里叶变换光谱（DRIFTS）和密度泛函理论（DFT）计算揭示了N-CDs和Ag_SA-CDs的反应机理。DRIFTS监测到Ag_SA-CDs在SOD-like和GPx-like反应过程中存在Ag-O₂•^?、Ag-OOH等关键中间体。DFT自由能谱图表明，Ag_SA-CDs中单原子Ag的引入显著降低了O₂•^?歧化和H₂O₂还原的反应能垒。Ag中心作为局域电子库和吸附位点，促进了氧中间体的稳定和质子耦合电子转移（PCET）过程，从而解释了其优异的双酶模拟活性。

2.5 Ag_SA-CDs和N-CDs纳米酶的细胞保护与抗氧化活性效应

流式细胞术和共聚焦显微镜分析表明，T-Ag_SA-CDs在HEK293T细胞中的摄取效率最高，并能特异性靶向线粒体。细胞毒性实验显示，N-CDs、Ag_SA-CDs和T-Ag_SA-CDs在0-200 μg/mL浓度范围内无明显细胞毒性。Ag⁺释放实验表明，Ag_SA-CDs在生理条件下稳定性好，Ag⁺释放量极低。在H₂O₂诱导的氧化应激模型中，T-Ag_SA-CDs能有效降低细胞内和线粒体ROS水平，恢复线粒体膜电位（ΔΨm），抑制细胞凋亡，并提升细胞内ATP水平、GPx活性，减少乳酸脱氢酶（LDH）泄漏。此外，T-Ag_SA-CDs还能显著抑制促炎细胞因子TNF-α和IL-6的表达，展现出抗炎效果。

2.6 纳米酶触发的ROS介导通路的分子调控

Western blot分析表明，在H₂O₂刺激的HEK293T细胞中，T-Ag_SA-CDs能下调KEAP1表达，促进NRF2核转位，进而上调HO-1和GPX4的表达，同时抑制NF-κB的活化。这揭示了T-Ag_SA-CDs通过直接清除ROS和激活内源性抗氧化信号通路（KEAP1-NRF2）发挥细胞保护作用的双重机制。体内生物分布研究显示，T-Ag_SA-CDs能优先在肾脏积聚，并在AKI小鼠模型中实现长效循环和有效清除。溶血实验和血液学参数分析证实了T-Ag_SA-CDs具有良好的血液相容性和生物安全性。

2.7 T-Ag_SA-CDs治疗AKI的体内疗效评估

在顺铂诱导的AKI小鼠模型中，T-Ag_SA-CDs治疗能显著提高小鼠生存率，减轻体重下降，并有效降低血清肌酐（CRE）和血尿素氮（BUN）水平，改善肾功能。组织病理学检查（H&E染色）显示，T-Ag_SA-CDs能有效保护肾小球和肾小管结构，减少组织损伤。TUNEL染色表明T-Ag_SA-CDs能显著减少肾脏细胞凋亡。免疫荧光染色进一步证实T-Ag_SA-CDs治疗能强烈激活肾脏组织中的NRF2/HO-1/GPX4信号轴。长期观察（21天）显示，T-Ag_SA-CDs治疗组小鼠肾功能指标恢复至接近健康对照组水平，表明其具有持续的肾脏保护作用。

2.8 Ag_SA-CDs的生物安全性评价

给药14天后，对小鼠进行全面的血液学和组织病理学评估。血常规参数显示，T-Ag_SA-CDs处理组与PBS对照组相比，白细胞、红细胞、血红蛋白和血小板计数均无显著差异，表明无血液毒性。主要器官（心、肝、脾、肺、肾）的H&E染色未发现坏死、炎症或结构损伤迹象，证实T-Ag_SA-CDs具有良好的系统生物安全性。

3 结论

本研究成功开发了一种新型诊疗一体化纳米酶T-Ag_SA-CDs，用于AKI的治疗。该纳米酶通过Ag单原子与碳点基质的协同作用，展现出卓越的SOD-like和GPx-like活性，能高效清除ROS。其线粒体靶向功能化实现了位点特异性抗氧化保护，在顺铂诱导的AKI模型中取得了显著的治疗效果。同时，其固有荧光特性实现了治疗过程的实时无创监测。该研究为设计下一代抗氧化纳米酶和诊疗平台提供了新思路，在ROS相关疾病治疗中具有广阔应用前景。

4 实验部分

（此处省略详细的实验材料、方法、表征手段、细胞实验、动物模型建立、疗效与安全性评价等具体步骤，因问题要求归纳总结而非罗列实验细节。）