《Journal of Hazardous Materials》：Towards safer deep eutectic solvents: insights from an in vivo study of reline toxicity under different preparation methods
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深共熔溶剂（DES）的毒性机制与制备方法密切相关。本研究以choline chloride/urea（1:2）配比的reline为模型溶剂，对比加热制备（reline_H）和冷冻干燥制备（reline_FD）的急性毒性及代谢影响。结果显示reline_H在1.8 g/kg剂量下引发胃部腐蚀性损伤，机制涉及热解产生的氨导致氧化应激和线粒体功能障碍；而reline_FD无毒性反应。该研究首次阐明DES的制备方法（热力学制备vs冷冻干燥）通过影响副产物（如氨）生成和代谢负担，显著改变其生物安全性，为DES的临床应用提供关键制备规范依据。
姜瑜雅|李成敏|姜秀芝|裴宝妍|陈静妍|查惠永|姜妍珠|金思妍|申秉秀|金亨植|李贞美
韩国京畿道水原市成均馆大学药学院，邮编16419
摘要
深共晶溶剂（DESs）作为一种环保替代品，通常通过加热制备；然而，尽管加热过程中可能产生副产物，但其制备条件的毒理学影响尚未明确。本研究旨在利用广为人知的由氯化胆碱和尿素（1:2）组成的模型溶剂reline，通过机制分析区分制备过程中的毒性与DESs本身的内在毒性。reline有两种形式：一种通过加热制备（reline_H），另一种通过冷冻干燥制备（reline_FD），两者在成分和共晶结构上相同，唯一的区别是产生的热副产物（如氨）。在1.8毫克/千克的剂量下，reline_H无论对雄性还是雌性ICR小鼠都会引起腐蚀症状和胃损伤，而reline_FD则能被良好耐受。机制研究表明，reline_FD的毒性源于其成分本身的代谢负担。相比之下，reline_H还会导致额外的生理紊乱，包括明显的氧化还原失衡、reline吸收加速以及氨清除延迟，这些都与碱性损伤有关；此外，它还会引起线粒体结构不稳定。综上所述，我们的发现表明reline的毒性来源于热副产物引起的碱性应激，而冷冻干燥可以减轻这种影响。随着DESs在生物相关领域的应用日益增多，这些发现表明，一种DES的安全性不仅取决于其成分，还可能取决于其制备历史。这突显了制备方法作为DES安全性的关键因素的重要性，尤其是在评估其未来应用时。
引言
随着人们对传统挥发性有机溶剂对环境和人类健康影响的担忧日益增加，对环保替代品的需求也随之上升[1]。在这种情况下，深共晶溶剂（DESs）因其低挥发性、不易燃性和易于制备而成为有前景的替代品[2]。与离子液体（ILs）不同，DESs可以通过简单的加热、冷冻干燥或蒸发方法制备[3]。DESs的可调成分使其具有多样的物理化学性质，从而在纳米纤维制备[4]、高价值蛋白质提取[5]和可穿戴生物传感器开发[6]等多个领域得到广泛应用。在药物递送系统中，DESs因其能够防止物质降解并提高溶解度和生物利用度而受到关注[7][8]。
在众多DESs中，reline由氯化胆碱和尿素以1:2的摩尔比组成，通常通过加热和搅拌制备[2]。由于其成本效益和优异的溶解性能，reline已被广泛应用于电化学研究[9][10]、材料科学[9][10]以及制药领域[11][12][13]。DESs的功能多样性使其成为制药领域的理想选择；然而，这也意味着在将其用于生物应用时需要进行安全性评估。
关于reline等DESs的潜在毒性和生物安全性，目前尚未达成共识[14][15]。尽管已有大量研究在细胞培养[16]、啮齿动物模型[17]和水生生物[18]等不同生物系统中探讨了其毒性，但大多数研究仅使用了有限的评估指标或单一暴露指标，因此对DESs的系统性影响了解有限[15][19]。此外，这些毒理学评估主要集中在DESs成分之间的差异上[20]。例如，基于铵的DESs在多种细胞系中表现出更高的细胞毒性和更多的活性氧（ROS）生成[21]。不同DESs的毒性差异有时被归因于其成分引起的pH变化[22][23]。我们之前的毒代组学研究表明，口服热制备的reline会导致急性毒性和与氧化及氨应激相关的代谢紊乱[24]。
值得注意的是，热合成的DESs可能含有加热过程中产生的副产物，这些副产物可能引发化学降解或副反应[25]。例如，有研究检测到热制备的reline中含有大量由尿素分解产生的氨[24]。这些发现表明，DESs的毒性可能源于这些副产物。然而，这些副产物的具体作用机制尚不清楚，因为它们的影响往往与DES本身的作用交织在一起。尽管DESs的热合成方法非常普遍，但不同制备方法对其毒性的影响尚未得到明确。
为了解决这一知识空白，本研究旨在明确区分制备过程中的毒性与DES本身的共晶效应，并利用reline作为模型溶剂对其毒性进行清晰的机制解释。为此，我们首先制备了两种形式的reline——一种通过热处理，另一种通过冷冻干燥——并仔细比较了它们的物理化学性质。随后，我们评估了热制备的reline在雄性和雌性小鼠中的急性口服毒性，以确定无观察到的不良效应水平（NOAEL）和最低观察到的不良效应水平（LOAEL）。接着，我们采用小鼠模型进行了比较毒代组学分析，以确定导致制备依赖性毒性的关键代谢紊乱。为了验证毒代组学结果并理解毒性机制，还对小鼠和大鼠进行了体外细胞实验和生化及分子分析。据我们所知，这是首次综合研究DES制备相关毒性途径的研究，为DES制剂的安全有效设计和制备提供了重要依据。
reline的化学成分及制备方法
本研究中使用的化学物质和仪器列在电子支持信息（ESI）的实验S1和表S1中。制备reline时，将氯化胆碱和尿素以1:2的摩尔比混合。reline_H是通过在80℃下加热并搅拌混合物2小时制备的。制备reline_FD时，在固体混合物中加入少量水（体积比约为1:6.3），随后将其冷冻干燥超过18小时
两种reline的物理化学分析
对通过热处理（reline_H）和冷冻干燥（reline_FD）制备的两种reline进行了详细表征。1H-NMR和FT-IR分析显示两种reline的总体化学结构没有明显差异（图2）。然而，在1H-NMR谱图中，氯化胆碱的羟基质子峰的分裂模式存在轻微差异：reline_FD的峰呈现为三重峰，类似于纯氯化胆碱的峰形结论
热制备和冷冻干燥的reline在成分和共晶结构上相同。然而，只有reline_H产生了有害副产物，并在体内引起剂量依赖性毒性，其NOAEL和LOAEL分别为0.5毫克/千克和1.0毫克/千克；而reline_FD在1.8毫克/千克的剂量下能被良好耐受。reline_H导致氧化损伤、系统吸收加速、氨清除延迟以及线粒体结构不稳定；然而，这些影响的相对贡献尚不明确
环境影响
虽然普遍认为DESs是安全的，但本研究表明，热制备的reline会导致胃组织碱性侵蚀、加速系统吸收，并在体内引发继发性氧化应激和氨代谢紊乱以及线粒体结构不稳定。这些发现表明，毒性可能并非源于DES本身的成分，而是源于制备过程中产生的副产物。相比之下，通过作者贡献声明
姜妍珠：方法学研究。李贞美：写作、审稿与编辑、监督、资源获取、概念构思。金亨植：资源提供、方法学研究。申秉秀：资源提供、方法学研究。金思妍：方法学研究、数据分析。裴宝妍：资源提供、方法学研究、数据分析。姜秀芝：数据可视化、方法学研究、数据分析。李成敏：方法学研究、数据分析。姜瑜雅：初稿撰写、数据可视化、方法学研究
致谢
本研究得到了韩国国家研究基金会（资助编号2022R1A6A1A03054419和RS-2023-00208174）的财政支持。作者感谢Seunghyun Kang先生在R脚本修改方面提供的技术帮助。
利益冲突声明
作者声明以下可能的利益冲突：李贞美表示获得了韩国国家研究基金会的财政支持。如有其他作者，他们也
