《Journal of Hazardous Materials》：Multi-omics reveals taxonomic and functional adaptations of soil microbiota to Bt toxin exposure
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本研究采用多组学方法系统解析Bt毒素浓度梯度下土壤微生物的群落结构及功能适应性机制，发现不同浓度的Bt毒素显著影响土壤毒素持久性及营养多功能性指数，但未改变微生物多样性，细菌与真菌通过能量代谢调整及环境适应基因上调实现适应性响应。
王璐瑶|梁子腾|梁京刚|葛雷|邹玲玲|范一轩|徐琴青|张颖|吕蓓蓓|赵凯|吴云飞|李鹏
上海农业科学院农业遗传与育种重点实验室生物技术研究所，中国上海201106
摘要
转基因Bt植物释放的Bt毒素具有生物杀灭活性，被视为土壤生态系统中的外源性环境危害。本研究采用综合多组学方法，系统分析了土壤微生物在Bt毒素不同浓度暴露下的分类学和功能调控机制及其适应策略。研究结果表明，不同剂量的Bt毒素显著影响了毒素在土壤中的持久性以及土壤营养多功能性（SNM）指数。值得注意的是，所有测试的Bt毒素浓度均未对土壤微生物群落的多样性和复杂性产生不良影响。相关性分析显示，SNM与细菌α多样性（Sobs指数和Shannon指数）及微生物网络边数呈显著正相关，但与真菌群落无此类关联，表明土壤细菌和真菌对Bt毒素的响应模式存在差异。在添加Bt毒素的情况下，微生物群落的分类学和功能多样性也表现出不同反应。通过比较Bt500_100和Bt0_100样本的转录组学分析，发现微生物下调了能量代谢途径，同时上调了与细胞运动性和环境适应相关的基因。这些结果共同表明，土壤微生物通过适应性代谢策略来缓解Bt毒素在土壤环境中生物可利用性下降所引起的营养限制。
引言
自1996年以来，具有改良宿主植物基因型的转基因（GM）作物已开始商业化应用。截至2023年，其种植面积显著增加，约占全球耕地面积的12%，相比1996年增长了约118倍[1]。Bt作物经过基因改造，能够表达来自土壤细菌苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）的Bt杀虫毒素，这些毒素可以杀死以这些作物为食的鳞翅目害虫，这类作物占据了全球抗虫转基因作物种植面积的最大比例[2]、[3]、[4]。与以前体形式产生原毒素的B. thuringiensis不同，Bt作物含有基因组插入的截短Bt基因，该基因被人工改造以编码活性毒素，其化学组成和结构与Bt原毒素有显著差异[5]、[6]。因此，Bt作物产生的Bt毒素可被视为具有生物杀灭活性的外源性生化化合物，可能对自然和农业生态系统构成风险[7]、[8]。Bt毒素能迅速且牢固地与粘土和腐殖酸结合，形成结合态的Bt毒素。结合态的Bt毒素保持其杀虫特性，并免受微生物降解，可在土壤中持续存在至少234天[9]。因此，Bt毒素可能在土壤中积累到对土壤微生物有害的浓度[8]。
土壤微生物通过分解枯落物、有机质矿化和养分循环在维持生态系统可持续性方面发挥关键作用，这些过程统称为土壤多功能性[10]、[11]、[12]、[13]。由于土壤微生物对自然和人为活动的高度敏感性，它们已成为环境扰动的高度敏感指标[14]。然而，暴露于Bt毒素的微生物群落与土壤多功能性之间的关系尚未明确，这构成了一个重要的知识空白，因为土壤是包含多种养分特性的复杂系统[15]。此外，这些发现有助于阐明围绕Bt毒素的核心争议：即它们主要是作为潜在的有毒物质还是作为养分来源[7]、[10]、[16]。此前已有研究分析了暴露于Bt毒素的土壤群落的分类学和功能组成，揭示了重要的群落特征及与环境相关的变异[16]。此类分类学信息有助于了解微生物间的相互作用，并有助于检测群落生态变化[17]。对群落功能组成的分析进一步揭示了微生物群落的功能能力及其如何随时间或环境条件的变化而变化[19]。群落分类组成与其功能特征之间的内在关联有助于理解土壤微生物组的功能生态学[20]、[21]，同时也阐明了微生物对变化环境条件的适应策略。
由于粘土-毒素复合物的结合使得氨基酸残基无法被微生物利用，结合态的毒素具有抗微生物利用性，并仍保持杀虫活性；而通过ELISA（酶联免疫吸附测定）在土壤中检测到的游离毒素可能作为碳和/或氮的来源[7]、[22]。事实上，许多研究通过分析土壤微生物群落的多样性、组成和网络复杂性来评估其对Bt毒素添加的响应[7]、[16]、[23]、[24]。然而，微生物群落在分类学和功能层面对于不同浓度Bt毒素的调控和适应机制仍大多不清楚。
我们假设Bt毒素的添加会显著影响土壤微生物组和代谢特征，特别是导致微生物分类学和功能多样性的变化。为了验证这些假设，我们研究了细菌和真菌群落在暴露于不同剂量Bt毒素100天后的响应。使用高通量扩增子测序技术来表征群落结构变化最大的组别。此外，还采用了包括宏基因组学、宏转录组学和代谢组学在内的多组学方法，探讨微生物群落活动及其代谢对Bt毒素添加的响应。本研究的目标是：1）分析土壤性质和SNM对Bt毒素添加的响应；2）识别影响微生物群落中分类单元和功能一致性的关键菌型；3）阐明活性微生物对Bt毒素添加引起的环境变化条件的适应机制。
实验设计
用于培养实验的土壤是从上海农业科学院所属的一个大型农场采集的壤土（坐标：31°13’18” N, 121°19’10” E），采集时间为2021年5月16日。该地区的土壤被认定为全球最肥沃的壤土类型。该农场未种植Bt作物。土壤样本在采集后放置在4°C的黑暗环境中保存了2周，直到培养实验开始。
Bt毒素在土壤中的持久性及土壤性质的变化
不同土壤样本中的Bt毒素浓度在进入土壤后迅速下降，并随着培养时间的延长而持续降低（见补充表S1）。不同浓度Bt毒素的降解曲线进一步证实了这一现象（见补充图1）。我们构建了一阶动力学模型（Y=ae^-b×X+c）来估算Bt毒素的降解动态（见补充表S2）。50%降解时间（DT50（d）
细菌和真菌对Bt毒素添加的不同响应
在本研究中，Bt毒素的添加改变了单一土壤性质，并影响了SNM，其影响随着初始Bt毒素添加量的增加和培养时间的延长而增强（见补充表S1）。蛋白质降解会产生氨基酸[29]，最终可能释放出氨和酮酸（见图6B）。因此，从土壤中的碳和氮营养物质计算出的SNM增加可能表明Bt毒素发生了降解。
结论
本研究表明，尽管Bt毒素在土壤环境中迅速降解，但其残留量仍会导致土壤微生物群落的分类组成和功能特征发生显著变化。值得注意的是，细菌和真菌对Bt毒素的响应模式存在差异，其中细菌可能是毒素降解的主要驱动因素。此外，我们的研究结果表明，土壤微生物通过
环境影响
Bt植物产生的Bt毒素与土壤颗粒紧密结合，持续保持杀虫活性，可能对土壤微生物造成长期的环境危害。然而，尽管微生物分类学和功能组成对于维持生态系统可持续性至关重要，但目前尚不清楚土壤生态系统对Bt毒素添加的具体响应机制。本研究扩展了我们对复杂分类单元-功能相互作用的理解
作者贡献声明
葛雷：软件开发、数据分析、正式分析、数据管理。梁子腾：软件开发、正式分析、数据管理。李鹏：撰写-审稿与编辑、资金获取、正式分析、数据管理。王璐瑶：撰写-初稿撰写、软件开发、正式分析、数据管理、概念构思。吴云飞：软件开发、数据管理、概念构思。梁京刚：方法学研究、数据分析。赵凯：正式分析、数据管理。吕蓓蓓：结果验证、软件开发、数据管理。
利益冲突声明
所有作者声明没有利益冲突。本文不包含任何涉及人类参与者或动物的研究。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：32471742、32071657）和生物育种重大项目（2023ZD04062）的财政支持。我们感谢LetPub（
www.letpub.com.cn）在本文撰写过程中提供的语言支持。
