聚氯乙烯的解聚和脱氯作用由粉虱幼虫源细菌实现

《Journal of Hazardous Materials》：Polyvinyl chloride depolymerization and dechlorination by Tenebrio molitor larva-derived bacteria

双菌株降解无添加剂PVC的机制与途径研究。从蚕蛹幼虫肠道分离出Acinetobacter sp. PVC-6A和Bacillus sp. PVC-6B，可利用PVC为唯一碳源，经35天培养使薄膜重量损失达2.5%-2.55%。多模式分析（SEM/AFM/ATR-FTIR/WCA）证实降解过程伴随表面粗糙化和化学结构改变，GC-MS发现新型氯代中间体1-氯十六烷。多组学分析鉴定出催化过氧化物酶（CAT）和漆酶（LAC1/LAC2）为关键酶，揭示多步脱氯降解新途径。提出PVC生物降解理论模型，为开发酶促降解技术提供依据。

　　

张慧|尹超凡|宋欣|周宁毅|徐颖

中国上海交通大学微生物代谢国家重点实验室、代谢与发育科学联合国际研究实验室以及生命科学与生物技术学院，邮编20040

摘要

聚氯乙烯（PVC）是一种持久性和生态毒性强的塑料，对环境构成严重威胁。在本研究中，从黄粉虫（Tenebrio molitor）的肠道中分离出两种细菌菌株：Acinetobacter sp. PVC-6A和Bacillus sp. PVC-6B。这两种菌株能够以PVC（分子量M_n为28 kDa、M_w为64 kDa、M_z为110 kDa）作为唯一的碳源，在30°C和pH 7.2的条件下培养35天后，分别使不含添加剂的PVC薄膜（尺寸为1 cm × 1 cm）的质量减少了2.55%和2.51%。通过扫描电子显微镜（SEM）、原子力显微镜（AFM）、ATR-FTIR和WCA等多种方法证实了这两种菌株对PVC的降解作用。气相色谱-质谱（GC-MS）分析检测到一种新的氯化中间产物1-氯十六烷，以及多种中链和长链脂肪酸，表明在PVC降解过程中发生了部分脱氯反应。这种氯化中间产物不仅支持了PVC-6A菌株的生长，还释放出了近乎化学计量的氯离子，进一步证明了其代谢过程中的脱氯作用。这种通过多步骤脱氯实现的降解途径与之前提出的PVC降解机制有所不同。基因组学和转录组学分析表明，过氧化氢酶（CAT）和两种漆酶（LAC1、LAC2）是参与PVC降解的关键酶。重组酶处理也能导致PVC的降解和脱氯，其中LAC1的活性最高，使PVC的分子量降低了13.1%，表面二氯化物（³⁵Cl^-）含量增加了77%。通过AlphaFold3预测的酶结构进行分子对接，阐明了酶与塑料之间的相互作用。本研究揭示了一种新的PVC生物降解途径，鉴定出了参与降解的酶，并提供了关于酶-底物结合的初步见解，从而加深了我们对PVC生物降解机制的理解，为开发针对这种持久性含氯污染物的生物酶修复策略奠定了理论基础。

引言

2023年，全球塑料产量达到4.138亿吨，其中90.4%为化石基塑料[1]。作为产量第三大的塑料（占总产量的8.4%），含氯量高达56.8%的聚氯乙烯（PVC）产生了大量废弃物[1]。塑料污染通过微塑料的形式对水生生态系统造成严重影响，这些微塑料是通过机械降解和光氧化作用产生的[2]、[3]。微塑料会导致氧化应激、炎症和生殖损伤[4]。传统的PVC处理方法会释放有毒的氯化化合物，如氯化氢和氯代二噁英[5]，因此需要采用微生物降解等环保替代方案[6]、[7]。由于聚烯烃塑料具有高度疏水性和较大的分子量，其生物可利用性极低，即使海洋环境中已广泛发现能够降解塑料的基因[8]，微生物也难以利用这些聚合物。然而，多项研究表明，包括PVC在内的多种塑料可以被某些昆虫、真菌和细菌降解[9]、[10]。

目前，关于PVC生物降解的研究仍落后于其他塑料，如聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）和聚乙烯（PE）。长期以来，昆虫被认为是降解塑料的潜在资源[9]。其中，黄粉虫幼虫已被证明能够降解多种塑料[11]、[12]。研究表明，昆虫与微生物的共生体具有转化难降解聚合物的潜力[13]。抗生素庆大霉素显著抑制了PVC（分子量M_w为143.8 kDa）的降解，表明肠道微生物群在PVC降解过程中起着关键作用[14]。在真菌方面，白腐菌能够降解低分子量的PVC[15]。此外，PVC薄膜还能为子囊菌的有性繁殖结构（子囊盘）提供附着和生长场所[16]。另外，一种海洋微生物群落[5]以及来自黄粉虫幼虫肠道的细菌群落EF1[17]也能降低PVC的分子量。

关于单一细菌菌株对PVC降解的研究进展较为缓慢。一种名为Altermonas sp. BP-4.3的海洋细菌菌株在处理60天后使PVC薄膜的质量减少了1.76%[18]。同样，Pseudomonas citronellolis在培养45天后使PVC薄膜的平均分子量降低了10%，而Bacillus flexus能够氧化PVC薄膜表面[19]。Pseudomonas aeruginosa和Achromobacter在接种180天后分别使含有增塑剂的PVC的拉伸强度降低了53%和43%[20]。然而，这些研究主要集中在PVC塑料的形态和物理化学变化上，而没有深入探讨其生物降解的机制[21]。

目前，关于酶促PVC降解的研究非常有限。有报道称真菌木质素过氧化物酶具有降解PVC的能力[22]。来自Spodoptera frugiperda幼虫肠道的Klebsiella sp. EMBL-1能够降解PVC并利用其作为生长养分[21]。此外，非特异性过氧化物酶也具有降解PVC的能力[21]。商业PVC薄膜通常含有增塑剂和其他低分子量添加剂，这些添加剂比PVC聚合物本身更容易被微生物利用。因此，观察到的薄膜重量减轻或表面侵蚀现象往往反映了这些添加剂的去除，而非PVC本身的真正分解，导致对PVC降解活性的高估。然而，大多数关于PVC生物降解的研究在解释微生物生长或重量变化数据时并未充分考虑添加剂的作用。关于不含添加剂的PVC被细菌菌株或酶降解的研究仍然有限，使得PVC生物降解的机制仍不甚明了。同时，PVC降解过程中的同时脱氯现象也尚未被充分研究。

在这里，我们报告了两种来自黄粉虫幼虫肠道的细菌菌株能够降解并利用不含添加剂的PVC作为生长基质。我们采用了扫描电子显微镜、原子力显微镜、傅里叶变换红外光谱和水接触角等多种方法来表征这两种菌株的降解能力。通过气相色谱-质谱（GC-MS）还检测到多种中间产物。通过多组学分析，鉴定出了三种能够降解PVC的酶。最后，基于中间产物的鉴定以及基因组和转录组数据的分析，提出了PVC的降解途径。鉴于目前关于PVC生物降解的研究有限，我们的研究将丰富可用于PVC降解的微生物菌株和酶的数据库，并为阐明PVC的降解机制提供证据。

化学物质和试剂

不含添加剂的PVC粉末（数均分子量M_n为28 kDa、重均分子量M_w为64 kDa、Z均分子量M_z为110 kDa）购自美国Sigma-Aldrich公司（CAS编号：9002-86-2）。ABTS和2,6-二甲基酚购自中国上海的上海阿拉丁生化科技有限公司。PVC薄膜的制备方法详见补充材料Text S1。随后将PVC薄膜切成1 cm × 1 cm、厚度为0.5 mm的小块

降解PVC细菌的分离与生物降解能力验证

在本研究中，我们从之前报道的来自黄粉虫幼虫肠道的PVC降解菌群[17]中分离出了两种细菌菌株。根据16S rRNA基因的系统发育分析，将它们分别命名为Acinetobacter sp. PVC-6A和Bacillus sp. PVC-6B（见图S1）。PVC-6A菌株呈短杆状（图1a），而PVC-6B菌株呈长杆状（图1b）。实验中以不含添加剂的PVC作为唯一的碳源用于细菌的生长

结论

在我们之前的研究[17]中，从黄粉虫幼虫的肠道微生物群落中成功获得了两种能够降解PVC的细菌菌株Acinetobacter sp. PVC-6A和Bacillus sp. PVC-6B，它们能够高效降解PVC并将其作为唯一的碳源进行生长。经过这两种菌株处理35天后，通过SEM、AFM、ATR-FTIR和WCA分析发现，PVC薄膜表面出现了典型的降解特征，如裂纹、表面粗糙度增加等

环境影响

PVC作为产量第三大的塑料，会以持久性白色污染物的形式累积。然而，能够有效降解PVC的微生物菌株和酶非常稀少。在本研究中，我们分离出了两种降解PVC的细菌菌株，鉴定出了三种关键酶，并提出了一种通过多步骤脱氯实现PVC矿化的新途径，为PVC的生物降解提供了重要的微生物学和理论依据。

未引用参考文献

[41], [42]

CRediT作者贡献声明

宋欣：撰写 – 审稿与编辑、资金获取。周宁毅：撰写 – 审稿与编辑、监督、资金获取。张慧：撰写 – 初稿撰写、数据可视化、验证、方法学设计、实验设计、数据分析、数据管理。尹超凡：撰写 – 初稿撰写、数据可视化、验证、方法学设计、实验设计、数据管理。徐颖：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、监督、资源协调、项目管理、资金申请

利益冲突声明

作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金（32270111）、江苏省合成生物学基础研究中心（BK2023300）以及广东省种子产业振兴项目（23050202）的支持。