《Journal of Hazardous Materials》：Dynamics of the plastisphere microbiome in agricultural soils under changing climatic conditions
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功能核酸分子优化、SMART策略、荧光增强、分子对接、多维度应用
Keren Chen|Xueying Li|Kai Dong|Weicheng Xu|Jiaru Yang|Ruobin Bai|Yuhan Cui|Feng Guo|Longjiao Zhu|Wentao Xu
中国农业大学营养与健康系精准营养与食品质量重点实验室，中源食品实验室，北京 100193
摘要
由于可用官能团数量有限，针对小分子的功能性核酸（FNAs）的开发一直面临挑战，这阻碍了有效结合元素和功能调节的创建。这一限制显著影响了小分子适配体的体内和体外应用，并阻碍了它们的药用潜力。在这项研究中，我们提出了逐步分子适配体优化和定制（SMART）策略，并以孔雀石绿（MG）结合DNA适配体为例，对其多功能性进行了优化，包括稳定性、荧光激活和结合亲和力。优化后的“灯泡适配体”CAG-T-ML-S4-TA-AT+1-4L的亲和力提高了27倍（Kd：1.173 μmol·L-1 → 0.044 μmol·L-1），热稳定性显著提高（Tm：42.77℃→ 61.55℃），荧光强度提高了近7倍，相对于自由MG分子提高了100倍。分子对接和动态模拟揭示了对靶标-适配体相互作用至关重要的结构特征。“灯泡适配体”作为一种强大的分子工具，其多功能性得到了进一步探索，应用范围扩展到：（1）生物传感，我们开发了一种比率计无标记适配传感器，具有宽检测范围（5 nmol·L-1-8 μmol·L-1-1
引言
功能性核酸（FNAs）由于其出色的分子识别和催化性能，在生命科学领域成为快速发展的焦点。这些可编程的核酸分子可以精确设计以执行多种功能，使其在生物传感、药物发现和环境监测中得到广泛应用[1]，[2]。在FNAs中，适配体是一个特别突出的类别，它们具有高亲和力、特异性和可编程性，使其成为研究最广泛和用途最广泛的分子工具之一[3]，[4]。
最近，基于适配体的治疗方法取得了显著进展，三种适配体药物——Pegaptanib、Apc001PE和Zimura——已获得美国食品药品监督管理局（FDA）的批准[5]，[6]，[7]。这些药物通过中和或抑制蛋白质-蛋白质相互作用途径发挥作用，并在治疗癌症和自身免疫疾病方面显示出成功。然而，尽管一些小分子结合适配体已经进入临床前研究阶段，但与针对蛋白质的适配体相比，它们的系统设计和多维度性能优化的策略仍然有限。
与蛋白质靶标相比，小分子具有更小的表面、更少的官能团和有限的结合位点，这在系统阐明适配体和小分子之间的结构-活性关系（SARs）方面带来了重大挑战[8]，[9]。这些固有的限制限制了小分子适配体的功能多样性，并阻碍了它们的药物化潜力。此外，与通常形成广泛氢键网络或形状互补口袋的蛋白质结合适配体不同，小分子适配体必须依赖更微妙的碱基堆叠、疏水接触和诱导契合的构象变化，使得合理优化变得更加困难[10]。此外，小分子适配体调节生物体内生理状态的潜力——类似于中和适配体或抗体的作用——仍然很大程度上未被探索。因此，研究小分子适配体的结合机制和功能应用不仅对于开发多功能适配体至关重要，而且对药物发现和分子诊断也具有重要意义。
孔雀石绿（MG）是FNAs领域的一个标志性小分子，因其独特的荧光特性而被广泛研究[11]。当与特定核酸序列结合时，MG通过限制分子内旋转（RIR）显示出显著的荧光增强[12]。已经开发了针对MG的RNA和DNA适配体，每种都有其独特的优势：经典的38-nt MG RNA适配体（MGA）具有高亲和力和超过2000倍的荧光增强，但合成成本高且核酸酶稳定性差；而较短的26-nt MG DNA适配体更稳定且成本效益更高，但亲和力适中且荧光增强有限——这突显了进一步优化的必要性[11]。自2003年发现MGA以来[13]，[14]，已经开发了包括Spinach[15]、Broccoli[16]、Pepper[17]和Corn[19]在内的荧光适配体，扩展了其在分子成像和生物传感中的应用。
作为FNAs领域的一个代表性小分子靶标，MG是研究适配体SARs和荧光机制的理想模型。此外，MG是一种已知的有害环境污染物，在水产养殖和食品产品中广泛检测到，其持久性和毒性对公共健康和生态系统构成直接风险。鉴于荧光适配器的广泛应用和重要性，我们之前利用MG RNA和DNA适配体，通过核酸可编程性和合理设计方法，设计了无酶、无标记且高灵敏度的荧光生物传感器[2]，[20]，[21]。这些努力实现了快速的即时检测（POCT）用于MG检测，同时提高了小分子适配体的亲和力和荧光强度。然而，传统的SELEX后优化方法通常一次只改进一个属性，并且缺乏统一的策略[22]。最近的高含量定制方法扩大了功能输出，但仍然特定于应用，并不提供全面的分子优化[2]，[23]。因此，仍然需要一个能够同时提高多个性能维度的通用优化框架。尽管在MG相关传感方面取得了进展，但MG适配体在体内或治疗用途上的潜力仍然很大程度上未被探索[20]，[21]，尽管它们调节生理状态的能力表明了在药物开发和FNAs基础技术方面的潜力。
在这里，我们假设对小分子适配体进行系统的、区域特定的优化可以显著提高它们的亲和力、稳定性和荧光性能。基于这一假设，我们的研究重点关注两个关键问题：（i）SELEX后优化结合高含量功能性核酸定制如何重塑适配体-配体相互作用并扩展多功能性；（ii）这样的优化适配体是否可以应用于多维度应用，包括生物传感、毒性中和和持续释放抗菌系统。更广泛地说，建立一个系统和合理的框架来改进小分子适配体对于实现其在生物传感、毒性调节、环境监测和抗菌应用中的实际使用至关重要。一种能够提高多个性能维度（如亲和力、稳定性、信号响应性和功能活性）的策略将大大推进FNAs在不同应用场景中的转化效用。
在这项研究中，我们使用MG DNA适配体作为模型，研究小分子适配体的结合机制并在体外和体内增强它们的多功能性。我们引入了逐步分子适配体优化和定制（SMART）策略，该策略涉及对适配体环区和茎区的系统优化，从而创建了“灯泡适配体”。这个框架被称为SMART——逐步分子适配体优化和定制，因为它将序列指导的优化与分子水平上的多维度性能增强结合起来。这种优化使亲和力提高了20多倍，热稳定性显著增强。在荧光性能方面，优化后的适配体与亲本序列相比，荧光强度提高了近7倍，相对于自由荧光分子提高了100倍。定制后的适配体展示了其作为强大核酸工具的潜力，具有广泛的应用。在生物传感中，优化后的适配体能够构建一个敏感的、无标记的比率计检测平台。此外，该适配体有效中和了细胞模型中MG引起的毒性，并延长了抗菌剂的杀菌活性，为感染控制提供了可持续的解决方案（图1）。这些发现为小分子适配体的设计和优化提供了宝贵的见解，为开发具有广泛生物医学和环境应用的多功能核酸技术奠定了坚实的基础。
材料与试剂
本研究中使用的所有寡核苷酸均由上海Sangon生物技术有限公司定制合成，序列可以在表S1中找到。26-mer原始序列参考自Wang等人[24]。Tris（三羟甲基氨基甲烷）由北京Biotopped Technologies有限公司提供。氯化钠（NaCl）、氯化钾（KCl）、硫黄素T（ThT）、MG和结晶紫（CV）购自Sigma-Aldrich Chemical有限公司。
逐步分子适配体优化和定制（SMART）
为了建立改进MG识别和信号输出的结构基础，我们首先应用SMART策略系统优化了MG DNA适配体的核心茎-环结构。这种逐步优化使我们能够将定义的序列编辑与稳定性变化、结合口袋配置和荧光激活联系起来。
结论
SMART策略成功用于优化了一种结合MG的DNA适配体。通过结构修饰，包括中心环优化、顶部环精细化、茎部定制和串联功能环连接，我们显著提高了适配体的稳定性、荧光激活和MG结合亲和力。优化的CAG-T-ML-S4-TA-AT+1-4L序列与亲本序列相比，荧光强度提高了近七倍，相对于自由
环境影响
孔雀石绿（MG）是一种持久且有毒的污染物，在水产养殖中广泛使用，对生态和健康构成严重风险。这项研究建立了一种SMART工程化的适配体，能够超灵敏地检测MG并有效解毒。通过阐明MG与核酸之间的分子识别机制，这项工作为设计基于核酸的材料用于污染物监测、毒性掩蔽和可控抗菌释放提供了基础。
CRediT作者贡献声明
Yuhan Cui：研究。Feng Guo：验证。Longjiao Zhu：写作——审阅与编辑。Wentao Xu：写作——审阅与编辑，概念化。Keren Chen：写作——原始草稿，方法学，形式分析，概念化。Xueying Li：方法学。Kai Dong：软件。Weicheng Xu：软件。Jiaru Yang：资源。Ruobin Bai：方法学。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系可能会影响本文报告的工作。
致谢
这项工作得到了中国国家重点研发计划（2022YFF0607900）；国家自然科学基金（32372437）；北京市科技计划项目（Z221100007122004）；北京农业研究系统创新联盟（BAIC01）；GENERTEC老年医学（肝胆）重点实验室；国中康健集团技术项目（GZKJ-KJXX-QTHT-20230626）的支持。
