《Annals of Neurology》：Clot Composition Profiling in Large Vessel Occlusion Stroke Via Radiomics
摘要
目的：探讨利用影像组学（Radiomics）这一无创成像技术，通过分析影像组学特征（RFs）来表征缺血性卒中血栓成分的可行性。血栓成分可能为卒中机制提供线索。
方法：研究分为两部分。第一阶段为前瞻性研究，比较机械取栓（MT）后获取的血栓的影像组学特征与组织病理学结果。血栓通过微计算机断层扫描（micro-CT）成像并进行组织学分析。通过匹配的micro-CT和组织学切片识别红细胞（RBCs）和纤维蛋白富集区域。提取影像组学特征，并采用多元逻辑回归识别与各成分相关的特征。使用Spearman相关性评估影像组学特征与成分百分比之间的关联。在取栓前的非增强计算机断层扫描（NCCT）上定位相同血栓并提取影像组学特征。将micro-CT和NCCT的影像组学特征进行关联，以实现基于组织学信息的解读。通过受试者工作特征（ROC）分析评估NCCT影像组学特征区分血栓成分的能力。第二阶段，将影像组学应用于包含不同病因的缺血性卒中患者的回顾性NCCT数据集。
结果：通过micro-CT分析了10个血栓。总能量（比值比[OR] = 1.35, 95%置信区间[CI] = 1.20–1.54, p< 0.001）和大依赖性高灰度强调（LDHGLE; OR = 1.18, 95% CI = 1.07–1.32, p= 0.01）与红细胞相关，并且在NCCT上与>70%的红细胞成分相关（Rho = 0.752 和 Rho = 0.815）。随后，分析了150例NCCT扫描，包括50例心源性栓塞、50例大动脉粥样硬化（LAA）和50例隐源性卒中。影像组学分析表明，72%的心源性栓塞血栓、30%的LAA血栓和50%的隐源性血栓以红细胞成分为主。
阐释：影像组学是一种有前景的无创血栓成分表征技术。
引言
约30%的急性缺血性卒中（AIS）无法确定病因。血栓成分，特别是分析红细胞（RBCs）和纤维蛋白的优势程度，可为AIS病因提供见解。例如，Brinjikji等人分析了1350名患者的血栓，得出结论：大动脉粥样硬化（LAA）来源的血栓比心源性栓塞来源的血栓具有更高的平均红细胞密度。同样，确定血栓成分也有助于评估对溶栓药物的反应。例如，Choi等人对52个血栓进行了组织学分析，得出结论：主要由红细胞组成的血栓更可能对静脉溶栓产生反应。然而，这些研究依赖于取栓术中获取的血栓的组织学检查，存在局限性。并非所有患者都接受取栓术，且血栓提取并非总是可行。此外，血栓成分的组织学分析并非常规临床护理的一部分。
理想的血栓评估方法应利用常规卒中成像数据，因为它可以在治疗前急性期确定血栓成分，且不改变标准卒中工作流程。影像组学是一种计算定量成像分析工具，能够从计算机断层扫描（CT）中逐体素量化成像特征。影像组学从医学图像中提取大量定量数据，可提供生化过程的替代信息。在这些提取的体素特征中，包括信号强度、粗糙度以及100多个额外的影像组学特征（RFs）。本研究旨在通过使用micro-CT将提取的影像组学特征与取栓后血栓的组织学成分相关联，来表征血栓成分，并进一步利用AIS诊疗期间获得的图像进行影像组学分析。
方法
研究遵循STROBE清单，在机构审查委员会（IRB）批准下进行，包括两部分。第一部分分析获得了患者同意，而IRB豁免了第二部分研究的患者同意。第一部分涉及一个前瞻性队列，比较取栓提取的血栓的影像组学特征与病理标本。将与micro-CT上特定血栓成分相关的影像组学特征匹配到在非增强CT（NCCT）图像上识别的等效特征。一旦通过影像组学分析推断出血栓成分，我们进行了研究的第二部分，即通过影像组学生物学解读NCCT扫描，并与大型患者队列的卒中病因相关联。
在第一部分分析中，每个取出的血栓都经过高分辨率micro-CT和组织学分析，以量化核心成分，包括红细胞和纤维蛋白。其他细胞成分，如白细胞和血小板，未进行分析，因为它们更难通过NCCT等无创成像技术分离，并且部分构成了以红细胞和纤维蛋白为主的更广泛血栓环境的一部分。然后使用基于区域的匹配将micro-CT提取的影像组学特征与血栓的组织学成分相关联。为了质量控制，两个已知成分的体外血栓——一个富含红细胞（≥90%），另一个富含纤维蛋白（≥90%）——使用相同的micro-CT协议进行扫描，并从预定义的感兴趣区域（ROIs）提取影像组学特征以进行比较和验证。
随后，将经过验证的与各组织学成分相关的影像组学特征用于分析相同10名患者的NCCT图像，以评估其在临床实践中的可重复性，旨在识别红细胞或纤维蛋白富集的血栓（由任一成分>70%确定）。选择70%的阈值是因为它接近文献报道值的中间点，其中红细胞富集或纤维蛋白富集血栓的成分阈值通常在60%至90%之间。然后，将与红细胞或纤维蛋白最强烈相关的影像组学特征用于分析来自不同卒中病因的更广泛患者队列的NCCT扫描。目的是评估这些影像组学特征从NCCT推断血栓成分并进而基于成像生物标志物估计潜在卒中病因的预测准确性。
影像组学特征提取：所有成像模态的分割均使用3D Slicer（版本5.6.1）进行。影像组学特征提取使用集成在3D Slicer界面中的PyRadiomics附加组件进行。对于NCCT，影像组学特征从其原始的亨氏单位（Hounsfield Unit）尺度的图像中提取，因为这些单位代表了在相同参数下获取的扫描之间固有可比性的X射线衰减的物理标准化度量。由于所有NCCT均使用统一的采集协议在同一台扫描仪上获取，因此未应用额外的强度标准化。Micro-CT灰度值本身未标准化，可能因探测器增益、光束能量和重建设置而异。因此，使用最小-最大缩放将体素强度标准化到0到1的范围，以考虑扫描仪依赖性差异并确保样本间的可比性。使用固定的箱宽度（NCCT为25，micro-CT为0.02）应用灰度离散化，选择这些参数以保持纹理稳定性和可重复的对比度分辨率。提取后，所有特征均在其原始尺度上进行分析，以确保一致的生物学解释和跨数据集的可重复阈值处理。
体内和体外血栓的组织学成像验证：取栓后获取的10个血栓进行了高分辨率micro-CT成像，随后进行了组织学分析。每个血栓以5μm各向同性体素分辨率进行micro-CT扫描，随后以5μm厚度切片进行组织学分析。实施配准以确保精确对齐。使用组织学标志物将组织学切片与相应的micro-CT切片匹配。正交平面对齐经过迭代优化，直到实现组织学图像与micro-CT的精确对应。基于已建立的micro-CT强度阈值，从红细胞和纤维蛋白的感兴趣区域（ROIs）提取影像组学特征，其中micro-CT高信号区域以红细胞为特征，低信号区域以纤维蛋白为特征。为了验证这些关联，两个体外血栓——一个富含≥90%红细胞，一个富含≥90%纤维蛋白——使用相同的micro-CT协议进行扫描。提取影像组学特征并与体内标本的特征进行比较，以确认特征谱的一致性。
Micro-CT与NCCT关联：在50%至59%或60%至69%的红细胞和纤维蛋白阈值内，未观察到micro-CT影像组学特征与成分之间的显著相关性。在敏感性分析中，micro-CT总能量（Rho = 0.752, p< 0.001）和LDHGLE（Rho = 0.815, p< 0.001）与组织学上红细胞含量超过70%的切片强相关。未发现micro-CT第10百分位数与纤维蛋白含量超过70%的组织学切片之间存在相关性。鉴于缺乏关联，研究中排除了纤维蛋白的进一步分析。
Micro-CT总能量和micro-CT LDHGLE与组织学分析显示红细胞含量超过70%的血栓（血栓3、4和9）的NCCT总能量（Rho = 0.657, p= 0.002）和NCCT LDHGLE（Rho = 0.687, p= < 0.001）强相关。ROC分析显示，总能量（曲线下面积[AUC] = 0.700, 灵敏度[SN] = 67%, 特异度[SP] = 71%, 阳性预测值[PPV] = 50%, 阴性预测值[NPV] = 83%, 阈值 = 38,244.31）和LDHGLE（AUC = 0.770, SN = 67%, SP = 86%, PPV = 67%, NPV = 86%, 阈值 = 52.64）能够准确判定NCCT中红细胞成分高于70%的血栓。
NCCT成像分析：卒中病因由两名不知情的血管神经学家（作者M.G.和E.A.S.）使用TOAST分类独立确定。根据出院摘要和随访数据，将其分类为心源性栓塞、大动脉粥样硬化（LAA）或隐源性。使用CTA的对比度截止值在NCCT上识别血栓的ROI以确定LVO。此过程在轴向、矢状和冠状平面上进行，随后进行形态学优化和手动轮廓校正以排除邻近血管壁和骨骼。所有分割在特征提取前均在3个平面上进行审查。三名评估者（作者A.G.、E.S.和C.D.）执行独立分割，两名血管神经学家（作者M.G.和E.A.S.）裁决差异以生成共识掩模。随后分离血栓并提取影像组学特征。
仅包括位于颈内动脉（ICA）终末段、大脑中动脉第一段（M1）或基底动脉（BA）的LVO。因潜在污染和影像组学特征处理中的伪影，排除了在首次NCCT可用之前接受过对比剂注射的病例。先前在研究第一部分获得并与红细胞和纤维蛋白富集成相关的经过验证的影像组学特征截断值应用于该NCCT成像队列，以估计主要的血栓成分。NCCT和CTA采集参数详见补充表S1。
统计分析：使用R软件版本4.3.3进行统计分析。对于第一部分分析，红细胞和纤维蛋白区域的micro-CT影像组学特征使用中位数和四分位距进行总结。使用Wilcoxon秩和检验评估成分间的差异。对于每个血栓成分，使用基于Akaike信息准则的前向逐步选择构建多元逻辑回归模型，最多4个预测变量以避免过拟合。进行了额外的多元逻辑回归模型，以识别与我们体外红细胞和纤维蛋白富集血栓相关的影像组学特征。这些模型作为特征选择步骤，以识别与红细胞和纤维蛋白独立相关的影像组学特征。保留的影像组学特征随后与组织学百分比成分相关联。使用Spearman相关性将micro-CT影像组学特征与红细胞和纤维蛋白含量>70%的组织学切片联系起来。然后，显示强相关性（Rho > 0.600 且 p< 0.05）的影像组学特征与来自相应成分>70%的血栓的NCCT影像组学特征进行比较。我们选择Rho > 0.6作为强相关性的截断值，因为该阈值已在影像组学研究中用于定义有意义的特征关联。进行探索性ROC分析以评估诊断性能，包括曲线下面积（AUC）、灵敏度（SN）、特异度（SP）、阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV）；使用Youden指数确定最佳截断值。对于第二部分分析，使用Kappa统计量确定两名裁决者之间卒中病因的一致性。使用双向随机效应计算组内相关系数（ICC），用于NCCT中的血栓分割。使用Kruskal-Wallis检验评估我们更广泛的NCCT数据集中不同卒中病因间的影像组学特征差异。由于分析的探索性性质，全文p值< 0.05被认为具有统计学意义。
结果
组织学成像验证：在2023年11月至2024年1月期间，前瞻性收集了10名接受取栓术的LVO患者的血栓。血栓被完整取出，无碎裂。人口统计学数据总结于表1。在取栓后获取的10个血栓中，8/10（80%）位于M1段，1/10（10%）位于ICA终末段，1/10（10%）位于BA。三个血栓主要由红细胞组成（血栓3、4和9），两个为纤维蛋白富集（血栓6和8）。一个血栓含有钙（血栓6）。其余5个血栓具有红细胞和纤维蛋白的混合成分（表2）。
影像组学分析显示，红细胞与较高的总能量（比值比[OR] = 1.35, 95%置信区间[CI] = 1.20–1.54, p= < 0.001）和大依赖性高灰度强调（LDHGLE; OR = 1.18, 95% CI = 1.07–1.32, p= 0.001）相关。纤维蛋白与较高的第10百分位数值相关（OR = 2.01, 95% CI = 1.12–3.89, p= 0.025；表3）。
从10个取栓获取的血栓中提取的与红细胞相关的相同影像组学特征，在体外红细胞血栓中也得到识别：总能量（OR = 1.64, 95% CI = 1.31–1.93, p= < 0.001）和LDHGLE（OR = 1.52, 95% CI = 1.23–1.74, p= < 0.001）。类似地，从10个取栓获取的血栓中识别的纤维蛋白的相同影像组学特征，在体外纤维蛋白血栓中也得到识别：第10百分位数（OR = 2.61, 95% CI = 1.54–4.8, p= < 0.001）。
Micro-CT和NCCT相关性：在50%至59%或60%至69%的红细胞和纤维蛋白阈值内，未观察到micro-CT影像组学特征与成分之间的显著相关性。在敏感性分析中，micro-CT总能量（Rho = 0.752, p< 0.001）和LDHGLE（Rho = 0.815, p< 0.001）与组织学上红细胞含量超过70%的切片强相关。未发现micro-CT第10百分位数与纤维蛋白含量超过70%的组织学切片之间存在相关性。鉴于缺乏关联，研究中排除了纤维蛋白的进一步分析。
Micro-CT总能量和micro-CT LDHGLE与组织学分析显示红细胞含量超过70%的血栓（血栓3、4和9）的NCCT总能量（Rho = 0.657, p= 0.002）和NCCT LDHGLE（Rho = 0.687, p= < 0.001）强相关。ROC分析显示，总能量（AUC = 0.700, SN = 67%, SP = 71%, PPV = 50%, NPV = 83%, 阈值 = 38,244.31）和LDHGLE（AUC = 0.770, SN = 67%, SP = 86%, PPV = 67%, NPV = 86%, 阈值 = 52.64）能够准确判定NCCT中红细胞成分高于70%的血栓。
NCCT成像分析：最初，430名患者被纳入NCCT成像分析。然而，430名患者中的280名（65.1%）因以下原因被排除：134/280名（47.9%）患者在NCCT图像中无可识别的血栓；128/280名（45.7%）患者在首次NCCT可用之前接受了对比剂注射；18/280名（6.4%）患者出现自发性再通。最终，分析了总共150名患者的NCCT图像（见表1）。两名裁决者在该队列中确定卒中病因方面达成了极好的一致性（K = 0.82）。类似地，NCCT中血栓分割的ICC极好（ICC = 0.89, 95% CI = 0.81–0.92）。
在这150名患者中，50/150名（33.3%）患有心源性卒中，50/150名（33.3%）患有LAA导致的卒中，50/150名（33.3%）患有隐源性卒中。120/150名（80%）患者的闭塞位于M1，25/150名（16.6%）位于ICA终末段，5/150名（3.3%）位于BA。
用于判定红细胞成分为主（>70%）的血栓的截断值，总能量 = 38,244.31 和 LDHGLE = 52.64，被用于分析所选150个血栓的特征。在心源性栓塞、LAA和隐源性血栓中，总能量（p< 0.001）和LDHGLE（p= 0.03）在这些病因之间存在显著差异。总能量和LDHGLE阈值在50例心源性栓塞中的36例（72%）、50例LAA中的15例（30%）和50例隐源性中的25例（50%）中识别出红细胞富集血栓（>70%）。
讨论
在本研究中，我们旨在使用基于影像组学的方法来表征血栓成分。由于影像组学提供逐体素评估，可以在最小化血栓成分异质性混淆效应的同时进行高分辨率空间分析。通过精确匹配micro-CT数据与组织学分析，我们识别出能够准确检测血栓中红细胞的影像组学特征。然后，我们将这些特征应用于相同患者的NCCT扫描，证明了在识别主要由红细胞组成的血栓方面具有高准确性。当对使用NCCT成像的更大卒中患者队列进行影像组学分析时，我们发现大多数心源性栓塞血栓富含红细胞（>70%成分）。
Micro-CT提供超高空间分辨率（5μm），并先前已用于将成像特征与血栓成分相关联。Saghamanesh等人使用micro-CT分析了3个取栓后获取的血栓，证明基于与电子显微镜的相关性，血栓的高信号区域对应于红细胞，而低信号区域指示纤维蛋白。类似地，在我们的研究中，红细胞主要位于具有较高总能量和LDHGLE的区域，这些区域与micro-CT中较高信号强度的区域相关。总能量是一个一阶影像组学特征，量化整体信号强度，而LDHGLE反映了高强度体素的空间聚类。因此，以较高信号强度（总能量）和空间相干强度模式（LDHGLE）为特征的区域与红细胞富集区域强相关。因此，红细胞富集血栓表现出更高的总能量和LDHGLE，反映了密集的红细胞堆积和更均匀的内部结构，在CT基成像上产生更高的体素强度和空间相干的信号簇。相反，纤维蛋白主导的血栓具有更异质、多孔的基质，具有更低且更可变的衰减，这可能解释了为什么我们没有发现与影像组学的任何相关性。相比之下，Santo等人报告了在10个血栓的micro-CT和组织学分析中，总能量与白细胞成分之间存在强相关性。然而，我们的研究结果表明较高的总能量与红细胞相关，而非白细胞。研究之间的差异可能源于CT采集方案和队列特征的差异。值得注意的是，在Santo的研究中，不清楚有多少患者在NCCT之前接受了碘对比剂注射，这是影像组学分析中已知的混淆因素。为避免潜在伪影，我们排除了所有先前有碘暴露的病例。类似地，Jiang等人报告称，影像组学在确定血栓成分方面比已知的放射学特征（如密度、长度和增强征）更准确。
血栓成分分析已用于确定卒中病因、预测取栓术的成功以及评估溶栓药物的疗效。理想情况下，应在初始NCCT时、干预前评估血栓成分，以告知卒中病因并指导治疗策略。在我们队列中，基于NCCT图像的影像组学分析显示，50例心源性栓塞血栓中的36例（72%）主要由红细胞组成。然而，先前的研究得出了不一致的结果，可能源于方法学差异。例如，Ahn等人报告心源性栓塞血栓中纤维蛋白含量较高，尽管他们队列中超过一半接受了溶栓治疗，且近90%的血栓碎裂。类似地，Liebeskind等人未发现与卒中病因相关的明确组织学模式；他们的分析依赖于亨氏单位测量来推断血栓成分，并受到血栓碎裂的限制，因为使用第一代取栓装置进行血栓取出。相比之下，我们的研究分析了150例NCCT的大型队列，并在化学或机械干预前研究了完整的血栓，这可能有助于红细胞优势与心源性栓塞起源之间的可能关联。在研究的验证阶段，取栓提取的血栓作为非碎裂标本获取。这与Minnerup等人的发现一致，他们表明红细胞富集血栓在淤滞条件下（心房颤动中常见）形成，而纤维蛋白富集血栓源于LAA中可见的内皮损伤。支持这一点，Shin、Kim和Sato等人报告心源性栓塞血栓中红细胞含量更高，LAA相关血栓中纤维蛋白更多。值得注意的是，在我们队列中，50%的隐源性血栓以红细胞为主，这可能表明一部分隐源性卒中可能具有潜在的心源性栓塞起源。
本研究有几个局限性。首先，这是一个单中心研究，在卒中病因裁决方面存在潜在偏倚；然而，裁决是盲法的，且两名裁决者在确定卒中病因方面达成了极好的一致性。类似地，我们研究的第一阶段包括了有限数量的血栓（n = 10）。然而，每个标本产生了5个匹配的组织学-micro-CT-NCCT相关性，总共50个独立数据点，为影像组学特征选择提供了可靠的组织病理学基础。因此，随后对NCCT中10个血栓进行的ROC分析被认为是探索性的，主要旨在为这些基于组织学信息的影像组学特征确定初步阈值。其次，我们通过micro-CT成像和组织学分析的10个血栓没有显著百分比的白细胞和钙成分；因此，未在micro-CT和NCCT上详细分析这些成分。类似地，未分析其他血栓成分，如血管性血友病因子和血小板，因为它们的百分比贡献太低，无法在NCCT上可靠识别。尽管如此，如先前作者所述，血栓可以大致分为红细胞或纤维蛋白血栓。以类似的方式，我们的影像组学分析未能在多个阈值下识别出与纤维蛋白成分的可重复相关性。这一局限性与先前的工作一致，表明纤维蛋白富集血栓在CT基成像上产生高度异质和低衰减模式，使得影像组学分辩具有挑战性。第三，大量患者被排除在NCCT成像分析之外，因为用于确定血栓边界的ROI是高度选择性的。这旨在最小化NCCT图像中非血栓成分的采样；因此，此步骤提供了具有影像组学的ROI的详细分析。最后，影像组学特征可能受CT采集参数影响。为最小化这种潜在混淆因素，我们确保了micro-CT影像组学特征与来自NCCT扫描的特征之间的紧密相关性。类似地，跨扫描仪和机构的影像组学可重复性仍然是一个挑战，因为采集参数的变化可能影响特征稳定性。使用多中心数据集和标准化的基于模体的校准协议将是协调影像组学和支持更广泛临床适用性的重要后续步骤。最后，尽管NCCT不是组织学金标准，但它用于评估在micro-CT上识别的基于组织学信息的影像组学特征是否可以在标准护理临床成像上检测到。因此，NCCT队列作为可行性评估，而非独立的生物学验证集。然而，包括使用标准化影像组学流程的不同中心的外部验证对于支持临床采用至关重要。
结论
在这项概念验证研究中，我们发现影像组学分析可以识别红细胞富集血栓，可能有助于确定卒中病因。未来，影像组学可以整合到一个完全自动化的流程中，能够在NCCT上表征血栓并实时提取基于组织学信息的影像组学。该工具可以作为高级可视化软件中的插件部署，促进快速、无创地估计血栓成分，并可能有助于确定卒中病因。
