《Clinical & Translational Immunology》：A comprehensive analysis of the correlation between plasma cytokines/chemokines and tumor immune microenvironment signature influences the response of checkpoint inhibitors in advanced non-small-cell lung cancer
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本文深入探讨了晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者在接受免疫检查点抑制剂（ICIs）治疗前，血浆中细胞因子/趋化因子（如IL-6、IL-8）水平与肿瘤免疫微环境（TIME）特征之间的相互作用及其对治疗反应的预测价值。研究通过整合多组学数据（包括27重细胞因子检测、免疫组化（CD8+TILs、Treg/FOXP3+、PD-L1 TPS）和RNA测序），揭示了循环IL-6/IL-8与中性粒细胞相关基因特征（如TREM1、SORL1、HSD17B11）及记忆B细胞的负相关性，并证实低IL-6/IL-8联合低中性粒细胞-淋巴细胞比率（NLR）可显著改善患者无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）。这些发现为优化ICIs疗效提供了新的生物标志物和潜在联合治疗靶点。
摘要
本研究旨在探索循环细胞因子/趋化因子与肿瘤免疫微环境（TIME）特征之间的相互作用，及其对晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者免疫检查点抑制剂（ICIs）疗效的影响。通过对81例接受ICIs治疗的晚期或复发性NSCLC患者进行前瞻性队列研究，分析了治疗前血浆27种细胞因子/趋化因子水平、免疫组织化学（CD8、Treg/FOXP3、PD-L1）和RNA测序数据。结果显示，治疗前血浆IL-6和IL-8水平与ICIs的替代反应和无进展生存期（PFS）显著相关。尽管多种细胞因子/趋化因子与CD8+肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）和Treg/FOXP3+TILs存在相关性，但IL-6和IL-8与瘤内或间质Treg/FOXP3+TILs、CD8+TILs及PD-L1无显著相关性。研究发现四个中性粒细胞相关基因特征（Neu_03_ISG15、Neu_04_TXNIP、Neutrophils_Rooney_et_al、Neutrophils_Danaher_et_al）与更好的ICIs疗效和较低IL-6水平显著相关。在这四个特征共享的69个基因中，TREM1、SORL1和HSD17B11的过表达与ICIs疗效正相关，且与CIBERSORT分析中的记忆B细胞呈负相关。临床分析显示，低IL-6/IL-8联合低NLR可识别出生存结局显著改善的亚组，而免疫组化检测的肿瘤浸润中性粒细胞计数未显示类似关联。本研究揭示了循环IL-6和IL-8通过肿瘤相关中性粒细胞和记忆B细胞影响ICIs疗效的潜在机制轴，强调了HSD17B11、SORL1和TREM1作为ICIs敏感性有前景的靶点。
引言
晚期或复发性非小细胞肺癌（NSCLC）的治疗已被精准医学显著革新，包括靶向治疗和免疫检查点抑制剂（ICIs）。对于无致癌驱动基因（如EGFR/ALK）改变的患者，FDA批准的ICIs已被广泛纳入晚期或复发性NSCLC的治疗方案。然而，尽管采用了PD-L1染色和肿瘤突变负荷（TMB）作为生物标志物，并非所有患者都表现出持久的临床反应，这可能是由于肿瘤和免疫活动之间复杂的相互作用。循环细胞因子/趋化因子是肿瘤与免疫系统之间重要的通讯介质。动态的循环细胞因子/趋化因子水平，如IL-5、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α，与含ICIs方案的临床结局相关。这表明细胞因子/趋化因子在晚期或复发性NSCLC的免疫治疗中直接或间接受到影响。肿瘤免疫微环境（TIME）在调节广泛的细胞因子/趋化因子中起着重要作用，这些因子可能促进或抑制肿瘤免疫逃逸过程。近年来多组学技术的进步为更全面理解癌症生物学提供了可能。本研究旨在全面探索循环细胞因子/趋化因子与TIME相关特征之间的相互作用，这些特征与晚期或复发性NSCLC的ICI结局相关。这些整合方法增进了我们对系统性细胞因子和趋化因子如何介导TIME特征及ICIs结局的理解。
结果
患者 demographic 特征
前瞻性队列研究招募了2020年1月1日至2023年3月31日期间的81名晚期或复发性NSCLC参与者。参与者的招募和实验室检测流程图见补充图1。数据截止时的中位随访时间为72.6周。85%的参与者在ICIs治疗期间出现疾病进展，67%的参与者死亡。参与者的 demographic 特征见表1。诊断时的中位年龄为68岁。大多数参与者为男性（80.2%）、既往或当前吸烟者（75.3%）、ECOG体能状态为0-1（88.9%）且为腺癌亚型（81.5%）。约70%的参与者有足够的组织进行PD-L1（22C3）染色，其中39.5%为阳性（≥1%），30.9%为阴性。大多数参与者接受ICIs单药治疗（74.1%）并在铂类双药化疗后作为后续治疗（72.8%）。ICIs治疗前或治疗期间接受放疗的比例为49.4%。根据ICIs反应的替代终点（应答者R：50.6%；无应答者NR：49.4%）分组的 demographic 特征均衡良好。整个队列的中位PFS和总生存期（OS）分别为14.7周和79.3周。使用替代终点作为对ICIs的反应，应答者和无应答者的中位PFS分别为32.9周和6.9周。应答者和无应答者的OS也与PFS一致。
治疗前血浆细胞因子/趋化因子表达改变与ICIs反应的相关性
与健康供体相比，接受ICIs治疗的晚期NSCLC参与者治疗前血浆中多种细胞因子/趋化因子水平显著改变，包括Th1细胞因子：IL-2、IL-12p70和IFN-γ；Th2细胞因子：IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13；趋化因子：IL-8、IP-10；以及生长因子：FGF、G-CSF、GM-CSF和PDGF-BB（补充表1）。在这些细胞因子中，只有IL-6和IL-8与ICIs治疗的替代反应显著相关（图1a）。根据检测中位值将参与者的治疗前IL-6和IL-8水平分为高、低两组。ICIs无应答组中高IL-6和高IL-8水平的比例（分别为72%和80%）高于ICIs应答组（分别为35%和50%）。此外，IL-6和IL-8均与ICIs治疗后的PFS和OS显著相关。低IL-6组和高IL-6组的中位PFS分别为22.4周和10.0周。低IL-8组和高IL-8组的中位PFS分别为23.7周和8.2周。总生存期也与PFS结果显著一致（图1d, e）。研究发现IL-6和IL-8水平之间存在强相关性（R: 0.46），这解释了它们与ICIs结局相似的相关性结果。结合临床因素的进一步分析显示，PFS的多变量分析确定诊断年龄、PD-L1染色和治疗前IL-8为显著因素。
血浆细胞因子/趋化因子表达与PD-L1、CD8和Treg/FOXP3免疫组化影响ICIs反应的相关性
循环细胞因子/趋化因子介导肿瘤与免疫系统之间的通讯，由肿瘤免疫微环境（TIME）分泌。尽管ICIs的结局据报道与CD8 TILs和PD-L1相关，但未观察到空间CD8 TILs和Treg/FOXP3与ICIs替代反应的相关性（补充表2）。我们进一步检测了细胞因子/趋化因子与TIME标志物之间的相关性。40个组织块可用于CD8、PD-L1和Treg/FOXP3免疫组化。瘤内和间质区室中CD8+和Treg/FOXP3+TILs的表达与几种血浆细胞因子/趋化因子显示出显著相关性（图2a）。发现了两组不同的相关性。第一组包括MIP-1β、IL-9、IFN-γ和MCP-1/MCAF（红框标记），第二组包括PDGF-BB、GM-CSF、IL-13和IL-5（黑框标记）。间质和瘤内CD8+TILs与MIP-1β、IL-9、IFN-γ和MCP-1/MCAF之间存在显著正相关。间质Treg/FOXP3+也与MIP-1β、IL-9、IFN-γ和MCP-1/MCAF呈正相关。相反，间质CD8+TILs和间质Treg/FOXP3+ TILs与IL-5、IL-13、GM-CSF和PDGF-BB之间存在显著负相关（图2b）。治疗前IL-6或IL-8均与瘤内或间质Treg/FOXP3+TILs、CD8+TILs和PD-L1 TPS评分无关。
血浆细胞因子/趋化因子与肿瘤免疫微环境相关特征影响ICIs反应的相关性
对20个通过质量控制的可用组织块进行了RNA测序，以探索循环细胞因子/趋化因子与肿瘤内在炎症信号通路之间的机制相关性。其中12例被定义为应答组，8例被定义为无应答组。进行了单样本基因集富集分析（ssGSEA）以探索322个TIME相关特征和组分。49个TIME相关特征在ICI反应组（R vs. NR）中差异显著。而在IL-6和IL-8水平上差异显著的TIME相关特征分别为13个和5个。其中，发现5个特征在ICI替代反应组和IL-6水平之间重叠，但IL-8没有（图3a）。大多数重叠特征（80%）与中性粒细胞相关，例如Neu_03_ISG15、Neu_04_TXNIP、Neutrophils_Rooney_et_al和Neutrophils_Danaher_et_al。个体和组ssGSEA评分与ICIs反应和IL-6水平相关见图3b, d。四个高中性粒细胞相关特征评分与更好的ICIs PFS显著相关，风险比（HR）为0.06–0.22（图3c）。进一步探索了这四个中性粒细胞相关特征通路共享的69个重叠基因，并分析了其个体显著基因表达（补充图3, 4；补充表8）。发现SORL1、TREM1和HSD17B11基因表达在ICIs替代反应和治疗前IL-6水平间差异显著（补充图5）。SORL1、TREM1和HSD17B11的过表达范围在低IL-6 vs. 高IL-6参与者中为2.28至3.67倍。SORL1、TREM1和HSD17B11的过表达在应答者 vs. 无应答者中也从2.58倍到4.0倍。此外，HSD17B11、SORL1和TREM1表达与CIBERSORT中性粒细胞显著正相关，与CIBERSORT记忆B细胞显著负相关（图4a, b）。高表达的HSD17B11、SORL1和TREM1与低IL-6水平和ICI应答者（R）相关（图4c）。Kaplan-Meier曲线显示TREM1、SORL1和HSD17B11高表达者的PFS更长。
中性粒细胞-淋巴细胞比率（NLR）和肿瘤浸润中性粒细胞的影响
NLR水平与ICIs反应相关。ICIs应答组的中位NLR为3.5，无应答组为7.3。使用中位值定义高/低NLR，68%的高NLR与ICIs无反应相关，而58%的低NLR与ICIs反应相关。此外，发现NLR与IL-8之间存在适度相关性，但NLR与IL-6之间无显著相关性。将NLR纳入IL-6和IL-8可以增强对ICIs疗效的区分。具体而言，低NLR/低IL-6或低NLR/低IL-8与更长的PFS/OS相关。低NLR/低IL-8 vs. 高NLR/高IL-8的中位PFS分别为32.3周和8.1周。中位OS分别为119.3周和38.5周。治疗前IL-6也观察到一致结果（补充图8）。此外，未观察到肿瘤浸润中性粒细胞的瘤内或间质分布与IL-6水平或IL-8水平之间的相关性（补充图9a, b）。肿瘤浸润中性粒细胞阴性者有更好的总生存期趋势，但PFS无显著差异（补充图9c, d）。在本队列中，9名参与者（21.4%）存在肿瘤浸润中性粒细胞。这些中性粒细胞上的PD-L1表达显示为无表达（补充表3）。
讨论
免疫疗法已成为无EGFR/ALK改变的晚期NSCLC的新标准治疗。不仅主要在临床试验环境中使用的PD-L1 TPS表达，包括细胞因子检测在内的几种生物标志物已被报道为与ICIs反应相关的表型。在27种细胞因子和趋化因子中，我们发现治疗前IL-6和IL-8水平与ICIs的结局相关，包括替代反应和PFS。高IL-6和IL-8组与较短的ICIs PFS和OS相关，这与先前报道一致。高IL-6与活性STAT3信号传导相关，随后抑制CD8+细胞毒性T淋巴细胞分化。在体内小鼠模型中，ICIs和抗IL-6联合应用具有协同增强抗肿瘤作用的效果。结合临床特征，治疗前IL-8似乎比IL-6影响更大。只有IL-8对ICIs PFS保持独立的预后意义。使用肿瘤组织RNA测序进一步研究了与IL-6和IL-8相关的显著TIME相关特征。结合ICIs结局，我们最终确定了四个中性粒细胞相关簇特征。肿瘤相关中性粒细胞（TANs）的功能异质性可分为抗肿瘤的N1和免疫抑制的N2表型。N1中性粒细胞以促炎细胞因子为特征，而N2表型由免疫抑制细胞因子驱动。TANs的功能异质性/对立性（N1 vs. N2）似乎与我们发现的在不同治疗前IL-6水平下的活性中性粒细胞相关簇特征结果相容。进一步探索了四个中性粒细胞相关特征中的基因表达，并确定了三个对ICIs结局影响最显著的基因，它们与不同水平的治疗前IL-6相关：HSD17B11、SORL1和TREM1。基于个体证据，HSD17B11、SORL1和TREM1在生物学上以直接或间接方式与ICIs相关。它们的高表达与低水平的IL-6、ICIs反应以及ICIs的PFS/OS相关。发现HSD17B11、SORL1、TREM1与IL-6以及CIBERSORT记忆B细胞呈负相关。我们的结果与高IL-6/IL-8水平与外周记忆B细胞和含有B细胞的三级淋巴结构减少相关的现象一致，这与肾癌和黑色素瘤中较差的ICI结局一致。我们的结果表明，TREM1、SORL1和HSD17B11的高表达可作为抗肿瘤性肿瘤相关中性粒细胞N1型的表型标志物。通过HSD17B11、SORL1和TREM1的作用，进一步阐明了中性粒细胞和B细胞在NSCLC ICIs治疗编排中的相互作用。中性粒细胞-淋巴细胞比率（NLR）已被报道与几种癌症的ICIs结局间接相关。NLR作为接受ICIs的NSCPI患者的替代免疫相关生物标志物。在无应答组中观察到高NLR比例，这与先前报告一致。因此，将IL-6/IL-8与NLR结合可以更好地区分ICIs的预后结局，低IL-6/IL-8和低NLR观察到最有利的结局。结合H&E检测肿瘤浸润中性粒细胞阴性者有更好的总生存期趋势，表明表型而非中性粒细胞的丰度在非小细胞肺癌ICI结局中的重要性。最后，我们声明研究的局限性。首先，前瞻性队列由接受不同ICIs的个体组成。Cox回归分析被纳入以确定独立因素。其次，可用肿瘤组织的限制性使我们在49.3%和24.6%的参与者中进行了CD8、Treg/FOXP3免疫组化和RNA测序。第三，替代反应由主治医师定义，可能不符合当前临床试验中的标准反应评估。第四，TANs以及HSD17B11、SORL1和TREM1的表达未通过免疫组化验证。尽管存在这些局限性，循环细胞因子、TIL免疫组化和TIME相关基因特征的全面分析为NSCLC中ICIs反应模式提供了分子见解。总之，我们的研究揭示了一个连接循环IL-6与肿瘤相关中性粒细胞、记忆B细胞和治疗反应的潜在机制轴。这些发现强调了协同治疗在增强ICIs疗效中的关键作用。此外，HSD17B11、SORL1和TREM1表达成为决定ICI敏感性的免疫环境中有前景的靶点。
方法
研究参与者
我们进行了一项前瞻性队列研究，在朱拉隆功国王纪念医院和玛希隆大学西里拉医院招募了81名晚期或复发性NSCLC参与者。符合以下纳入标准的参与者被纳入研究。所有参与者在采血前均提供了知情同意。该研究获得了朱拉隆功大学医学院和玛希隆大学机构审查委员会的批准，并符合HIPAA和《赫尔辛基宣言》进行。
研究终点
从医疗报告中获取招募的NSCLC患者的临床病理数据。本研究的临床终点包括PFS和OS。ICIs治疗的反应由电子计算机断层扫描评估，并在第3-4个ICIs周期后由主治医师评估，之后每3个月一次。我们将反应模式定义为替代终点。PFS和OS事件在2023年3月31日截尾。
血样采集和血浆提取
在ICIs第一个周期前从晚期NSCLC参与者获取全血样本。另外招募了30名胸部X光检查正常的健康志愿者作为对照组。将全血离心，分离血浆并保存在-80°C直至分析。
治疗前NLR评估
治疗前NLR是根据ICIs治疗前获得的全血细胞计数计算的。NLR通过中性粒细胞绝对计数除以淋巴细胞绝对计数计算。NLR的中位值被指定为截断值，将患者分为高NLR和低NLR组进行进一步分析。
细胞因子/趋化因子 assay 定量
使用Bio-Plex Pro Human Cytokine 27-plex Assay进行细胞因子和趋化因子的全面评估。简要来说，将血浆稀释后加入到预包被的微孔板孔中，孵育和洗涤后，使用Bio-Plex 200系统和软件测量荧光信号。细胞因子和趋化因子浓度通过与标准对照归一化后估算。
CD8、PD-L1和FOXP3免疫组织化学
使用石蜡包埋切片进行CD8+T细胞、FOXP3+调节性T细胞和PD-L1肿瘤比例评分的蛋白表达检测。由对结局和其他研究结果不知情的一位合著者评估CD8+、Tregs/FOXP3+和PD-L1的表达水平。进一步评估H&E染色组织切片中的中性粒细胞百分比，并将其分为瘤内中性粒细胞和间质中性粒细胞。随后评估PD-L1染色切片上的中性粒细胞表达。
Bulk RNA测序和生物信息学流程
从石蜡包埋组织中提取RNA。质量控制后，使用Agilent SureSelect XT HS2 Human All Exon V8进行文库构建和靶向富集。使用NovaSeq进行测序。使用STAR比对器将RNA数据与人类参考基因组比对。使用Salmon量化基因表达计数。进行单样本基因集富集分析以探索322个肿瘤免疫微环境相关基因特征和组分。使用DESeq2进行显著肿瘤免疫微环境相关特征的差异基因表达分析。使用CIBERSORT工作流程提取相对TIME组分和丰度。
统计分析
使用R软件分析研究数据，并使用GraphPad Prism可视化。使用Mann-Whitney-U和卡方检验确定连续变量和分类变量之间的差异。Spearman和Pearson相关系数衡量两个独立变量之间的关系。使用Kaplan-Meier方法和对数秩检验估计PFS和总生存期，并确定影响这些结局的因素。使用Cox比例风险模型评估独立预后因素。统计显著性水平的P值截断值确定为<0.05。使用Benjamini-Hochberg校正对多重比较的P值进行错误发现率调整。
