《Journal of Orthopaedic Translation》：VEGF-neutralized platelet-rich plasma with adipose-derived stromal vascular fraction enhanced osteochondral repair in a point-of-care goat model
编辑推荐：
本研究针对关节软骨缺损自愈能力差、现有疗法效果不一的难题，探索了在单次手术中联合应用脂肪来源基质血管组分（SVF）与血管内皮生长因子（VEGF）中和化富血小板血浆（PRP）的策略。研究发现，VEGF(?) PRP能体外促进间充质干细胞（MSC）向透明软骨分化，并在山羊骨软骨缺损模型中倾向于产生更优的修复效果，其修复组织更接近天然软骨的表型和力学性能，为开发针对特定病理的定制化PRP疗法提供了新思路。
想象一下，您的膝关节软骨上出现了一个小破损，就像汽车挡风玻璃上的一个裂纹。不幸的是，由于软骨组织缺乏血液供应，这个小小的破损无法自行愈合。如果不加干预，它可能会逐渐扩大，最终导致整个关节退化，引发骨关节炎，带来长期的疼痛和行动不便。这正是全球数百万骨关节炎患者面临的困境。目前，临床上常用的自体软骨细胞移植（ACI）等技术虽然有效，但通常需要两次手术：第一次取出健康的软骨细胞，在实验室培养扩增，第二次再将其植入受损区域。这个过程不仅给患者带来额外痛苦和不便，也显著增加了医疗成本和感染风险。因此，开发一种高效、便捷的“一站式”软骨修复方案，成为了骨科领域迫切的追求。
组织工程技术的出现为这一目标带来了希望，其核心在于巧妙地组合三种要素：具有修复潜能的细胞、促进细胞生长的因子以及承载细胞的支架材料。其中，间充质干细胞（MSC），特别是从脂肪中获取的脂肪来源干细胞（ASC），因其强大的增殖和多向分化能力备受青睐。而富血小板血浆（PRP），作为一种通过离心自体血液获得的、富含多种生长因子的天然制剂，也被广泛用于促进组织修复。然而，PRP的成分非常复杂，其中含有的血管内皮生长因子（VEGF）等促血管生成因子，已知会抑制软骨形成并可能加速骨关节炎进展。这就像一把双刃剑，PRP在带来修复希望的同时，也可能暗藏阻碍完美软骨再生的因素。那么，一个关键的科学问题浮出水面：如果能够“改造”PRP，特异性地中和掉其中的VEGF，是否能够优化其促进软骨再生的效果？更进一步，如果将这种改良后的PRP与能够快速获取的脂肪基质血管组分（SVF，富含MSC的细胞混合物）相结合，能否在大型动物模型中实现更理想的骨软骨修复，并且在一个手术时间内完成（即“点对点护理”或“一站式”手术）？
为了回答这些问题，由Shinsuke Kihara、Benjamin B. Rothrauff、Tomoya Iseki、Kalon J. Overholt、Yijen L. Wu、Hang Lin、Peter G. Alexander和Rocky S. Tuan组成的研究团队，在《Journal of Orthopaedic Translation》上发表了一项研究。他们提出假设：VEGF中和化的PRP（VEGF(?) PRP）在体外能增强脂肪干细胞（ASC）的软骨形成，在体内与SVF联合应用时，能改善点对点护理山羊模型中的骨软骨修复。
为验证假设，研究人员首先在体外实验中，将山羊脂肪干细胞（ASC）包裹在一种光交联的明胶/透明质酸水凝胶中，并分别加入不同的补充剂：Hanks平衡盐溶液（HBSS，阴性对照）、普通PRP、VEGF(?) PRP或转化生长因子-β3（TGF-β3，阳性对照）。培养21天后评估细胞活力和软骨形成、纤维化、肥大等相关基因的表达。随后，他们建立了临床相关的点对点护理山羊模型。在单次手术中，从山羊的膝关节脂肪垫（IFP）中获取SVF，从颈静脉血制备PRP，并在缺损处植入含有自体SVF和上述四种不同补充剂之一的水凝胶构建体。手术后6个月，通过大体观察、组织学评分、免疫组织化学（检测II型、I型、X型胶原蛋白）、生物力学测试（测定弹性模量）以及定量核磁共振成像（UTE-T2* mapping）等多种方法，全面评估骨软骨缺损的修复质量。
本研究主要应用了以下关键技术方法：1. 点对点大型动物模型构建：采用西班牙山羊建立股骨内侧髁骨软骨缺损模型，并在单次手术中完成SVF和PRP的获取、处理及植入。2. PRP制备与VEGF中和：通过二次离心法从自体血制备PRP，并使用抗VEGF抗体进行中和。3. 光交联水凝胶技术：使用甲基丙烯酰化明胶（mGL）和甲基丙烯酰化透明质酸（mHA）制备可光固化的三维细胞载体。4. 多模态修复效果评估：结合组织学、免疫组化、生物力学测试和定量MRI（UTE-T2* mapping）对再生软骨进行综合表征。
3.1. 体外细胞活力
在所有实验组中，封装在光交联水凝胶中的脂肪干细胞（ASC）在21天的培养期内均保持了高细胞活力（约86%-91%），组间无显著差异。这表明PRP、VEGF(?) PRP和TGF-β3的补充对细胞存活没有不利影响。
3.2. 体外基因表达
基因表达分析显示，TGF-β3组在所有时间点均显著上调了软骨形成标志物（COL2, ACAN）的表达。与普通PRP相比，VEGF(?) PRP在培养第21天显著上调了COL2和ACAN的表达，同时显著抑制了纤维化标志物COL1的表达。TGF-β3在早期强烈上调了肥大标志物（COL10, MMP13），而PRP和VEGF(?) PRP仅随时间有轻微增加。结果表明，VEGF(?) PRP在促进软骨形成的同时，能抑制纤维化，倾向于引导细胞向更理想的软骨表型分化。
3.3. 体内PRP成分表征
PRP中的血小板浓度相较于全血平均富集了约2.7倍，而白细胞浓度则降低了约20倍。制备VEGF(?) PRP所用的抗VEGF抗体处理，并未显著改变PRP中的血小板、白细胞、总蛋白或VEGF（指中和前测得的含量）浓度，确保了组间比较的有效性。
3.5. 软骨修复的大体外观
术后6个月，根据国际软骨修复协会（ICRS）大体评分标准进行评估。VEGF(?) PRP组和TGF-β组的修复组织与周围天然软骨的整合更平滑。HBSS和PRP组常可见新生组织与周围软骨之间存在缝隙。TGF-β组部分样本出现修复组织过度增生。虽然VEGF(?) PRP组得分最高（10.0 ± 1.6），但组间差异未达统计学显著性。
3.6. 骨软骨修复的组织学评价
苏木精/伊红（H&E）和沙弗-O/固绿染色后进行组织学评分。VEGF(?) PRP组更一致地表现出光滑的表面、与邻近天然软骨的连续性以及富含蛋白聚糖的新生软骨层。TGF-β组常显示比天然软骨更厚的沙弗-O染色区域，并伴有异位骨形成的局灶区域。VEGF(?) PRP组评分最高且方差最小（21.8 ± 1.9），但与其他组无统计学差异。
3.7. 骨软骨修复的免疫组织化学评价
对II型胶原（Col-2，透明软骨标志）、I型胶原（Col-1，纤维软骨/瘢痕组织标志）和X型胶原（Col-10，肥大软骨标志）进行半定量分析。VEGF(?) PRP组的Col-2染色光学密度（OD）显著高于PRP和TGF-β组。在新生软骨区域，VEGF(?) PRP组几乎无Col-1染色，而其他组则显示较强的Col-1染色。计算Col-2/Col-10 OD比值作为软骨表型稳定性的指标，VEGF(?) PRP组的比值显著高于其他三组，表明其更倾向于形成透明软骨并抑制软骨细胞肥大。
3.8. 修复软骨的弹性模量
通过压痕测试测定修复组织与对侧膝关节天然软骨的平衡弹性模量比值。TGF-β组的弹性模量比值（2.11 ± 0.54）显著高于HBSS、PRP和VEGF(?) PRP组（约0.86-1.16），表明TGF-β诱导的修复组织力学性能“超生理”，过于僵硬，这与骨样组织形成相关。而VEGF(?) PRP组的比值（1.16 ± 0.06）最接近天然软骨。
3.9. UTE T2mapping核磁共振评估*
超短回波时间（UTE）T2* mapping用于评估软骨基质生化成分。TGF-β组的平均UTE-T2值（1.07 ± 0.11 ms）极显著低于天然软骨（6.04 ± 0.60 ms）和其他处理组（约7.26-7.79 ms），提示其基质过于致密，可能与矿化或异位骨形成有关。VEGF(?) PRP组的T2值（7.26 ± 1.45 ms）与天然软骨及其他组（除TGF-β外）更接近。
3.10. 各项结果间的相关性分析
组织学评分与ICRS大体评分、Col-2 OD以及Col-2/Col-10比值呈显著正相关。UTE-T2* MRI值与力学测试结果（弹性模量比值）和Col-10 OD呈显著负相关。这些结果表明，更高的Col-2/Col-10比值反映了更接近透明软骨的表型，并与更好的组织学评分和生物力学完整性相关。
本研究的主要结论是，在PRP中中和VEGF，在体外能增强脂肪干细胞（ASC）的软骨形成，并抑制纤维化；在体内与SVF联合应用于点对点护理山羊模型时，倾向于产生更优的骨软骨修复效果。尽管由于大动物实验样本量有限，许多指标的组间差异未达到统计学显著性，但VEGF(?) PRP组在宏观外观、组织学结构、胶原蛋白组成（高Col-2/Col-10比值）和生物力学性能（弹性模量接近天然软骨）方面， consistently表现出最接近天然骨软骨组织的修复趋势。
讨论部分强调了该研究的转化潜力。当前临床使用的PRP是成分复杂的“混合物”，其效果因具体病理而异。针对软骨修复这一特定场景，抑制其中的促血管生成因子（如VEGF）可能是优化疗效的关键。这项研究首次在大型动物模型中验证了VEGF中和化PRP联合SVF用于一站式软骨修复的可行性，为开发“量身定制”的PRP疗法提供了临床前证据。然而，这种对生物制剂成分的有意修改（如使用酶消化获取SVF、用抗体中和VEGF）面临着严格的监管挑战。未来的研究方向可能包括探索非酶法获取细胞组分（如微碎片脂肪）、使用同种异体PRP/MSC产品以克服自体产品的变异性，以及开展设计严谨的临床试验，但所有这些都必须遵循国家和国际监管标准。总之，这项研究标志着在追求高效、便捷且具有针对性的软骨再生策略道路上迈出了重要一步。
