《Marine Mammal Science》：First Comprehensive Study of Telomere Length Measured by Southern Blot Hybridization and Oxidative Stress Across 12 Captive Marine Mammal Species
引言
对于种群数量下降的濒危物种而言，环境变化的直接不利影响以及这些变化诱导的生理应激的间接效应，通过降低个体适应度对物种生存构成显著风险。尽管皮质醇等应激激素已被广泛用作动物应激指标，但其水平易受短期波动影响，且可能反映采样过程中诱导的应激，这构成了一定的局限性。相比之下，与生理成本相关的端粒和氧化应激，作为相对较长时期的应激指标受到关注。然而在海洋哺乳动物中，这些指标的应用仍然有限，主要由于样本采集的挑战。本研究通过将端粒长度（TL）和氧化应激标志物应用于多种圈养海洋哺乳动物物种，旨在填补这一空白，为物种特异性应激生理学提供新见解。
端粒是真核生物染色体末端的重复DNA序列，在脊椎动物中保守为5′-TTAGGG-3′重复序列。TL随着与衰老相关的DNA复制而缩短，氧化应激也会加速端粒缩短。氧化应激是活性氧（ROS）与抗氧化防御之间失衡的结果，是野生动物行为和环境挑战相关生理成本的关键指标。慢性应激源可能导致ROS产生或抗氧化能力降低，从而可能导致端粒缩短。相反，延伸端粒的逆转录酶端粒酶也存在。在哺乳动物中，红细胞无细胞核，白细胞是血液中唯一的核细胞，因此TL通常在白细胞中测量。有研究报道，淋巴细胞在白细胞中的比例（作为唯一表达端粒酶的白细胞）会影响TL测量。
近期研究聚焦于氧化应激介导的端粒缩短机制及白细胞中淋巴细胞比例，旨在通过测量TL及其变化速率来评估个体在一定时期内经历的慢性应激。此类TL和氧化应激水平对各种应激源的反应变化已在鸟类和陆地哺乳动物中有报道。相比之下，收集海洋哺乳动物样本具有挑战性；因此，其端粒数据仍然有限。在已知的130种海洋哺乳动物中，TL仅在9个物种中被检测或测量过。Southern印迹杂交法是测量绝对TL最准确的技术。在上述9种海洋哺乳动物中，仅有5种（4种鲸豚类和1种鳍足类）使用该方法测量了TL，且先前研究测量了来自不同组织（如皮肤、肺、肾、角膜的原代培养细胞以及血液白细胞）的TL，导致组织来源不一致。跨不同类群的研究观察到TL的组织特异性差异，且这些差异因物种而异。因此，基于先前使用Southern印迹杂交法研究海洋哺乳动物端粒的结果进行种间比较具有挑战性，阻碍了对物种特异性TL趋势的准确理解。
为填补海洋哺乳动物TL基础数据的空白，本研究使用Southern印迹杂交法测量了12个物种（包括鲸豚类和鳍足类）共42只圈养个体白细胞中的TL。此外，我们评估了来自同一样本的氧化应激标志物（活性氧代谢物[d-ROMs]和生物抗氧化潜能[BAP]）以及白细胞中的淋巴细胞比例。本研究试图通过检查TL、氧化应激和个体年龄之间的关系，为海洋哺乳动物端粒动力学的基本机制提供新见解。
方法
数据采样与实验准备
42只个体饲养于日本四个水族馆。包括6种鲸豚类（26只个体）和6种鳍足类（16只个体）。本研究在COVID-19大流行期间进行，因此选择了靠近第一作者和通讯作者大学的四个水族馆。为最大限度减少应激并遵守伦理和感染控制指南，采样仅限于通过驯养技术训练为自愿采血且无需约束的动物。因此，个体和物种数量反映了参与水族馆可用的最大可行样本量。
在2021年7月至2023年10月期间，于常规健康检查期间收集剩余血液样本（每只个体约3–6 mL）。血液由各机构的兽医从鲸豚类的尾鳍静脉和鳍足类的后鳍状肢静脉抽取。为防止凝血，血液样本迅速分装到预先装有肝素钠粉末的2.0 mL微量离心管中并冷藏。
抵达实验室后，样本分为两部分：一部分用于TL和氧化应激测量，另一部分用于白细胞分类分析。第一部分在20°C下以6000 rpm离心10分钟。随后，小心提取血沉棕黄层（含用于TL分析的白细胞）和血浆（用于氧化应激测量），各取600 μL等分试样转移至单独的1.5 mL微量离心管中。血浆在-30°C冷冻直至氧化应激实验，而血沉棕黄层立即用于后续实验。
DNA提取
使用DNeasy Blood & Tissue Kit从血沉棕黄层中提取基因组DNA。遵循试剂盒的“从动物血液或细胞中纯化总DNA（离心柱方案）”协议，分八个步骤进行。为实现两个类群间可比的DNA产量，每次提取时相应调整血沉棕黄层体积，鲸豚类使用80 μL，鳍足类使用100 μL。体积差异反映了鲸豚类和鳍足类之间血细胞浓度的差异。在DNA提取前，加入磷酸盐缓冲盐水（PBS）将总液体体积调整至220 μL。根据Hori等人描述的方法提高了DNA产量。孵育时间从1分钟增加到5分钟。DNA在20°C下以8000 rpm离心1分钟，每管洗脱到150 μL Buffer AE中。通过对每个血沉棕黄层样本进行两次提取运行，获得总共300 μL的最终洗脱体积。提取后，使用分光光度计对每个样本的DNA浓度测量两次。从每个血液样本中获得约6管提取的DNA（每管约300 μL），平均DNA浓度为22.0 ± 16.2 ng/μL。这些提取物在-30°C储存直至端粒长度测量实验。
端粒长度测量
DNA样本在TL测量前解冻1小时，并使用乙醇沉淀浓缩两次。使用分光光度计确认DNA纯度（A260/A280比值）在1.7–2.0范围内（平均值1.8 ± 0.1）。使用TE缓冲液将每个样本的浓度调整至300–330 ng/μL（15 μL中含4.5–5.0 μg DNA）。最终体积调整至30 μL，样本分装到两个单独的1.5 mL微量离心管中，各15 μL。使用TeloTAGGG Telomere Length Kit检测端粒序列，遵循Sakai等人描述的Southern印迹杂交方案。化学显影后的膜使用扫描仪扫描，并将TIFF图像数据导入计算机。所有实验在25°C下进行。所有样本在同一实验室、使用相同设备、由同一实验员在相同电泳条件下进行测试。
根据Sakai等人描述的方法计算TL。使用ImageJ从膜图像数据量化端粒条带（拖尾）强度。首先，使用“Subtract Background”功能处理捕获的图像以均一化背景。接着，使用“Uncalibrated OD”功能将灰度值转换为光密度值。使用“Plot Profile”功能测量每个泳道的电泳距离和光密度。根据这些数据，通过将标记条带的分子量与其迁移距离进行多项式或幂近似曲线拟合，生成校准曲线。选择具有最高R2值的曲线，且近似在所有情况下拟合良好（R2> 0.99）。
本研究中，使用TRF法确定的TRF值作为TL的度量，并根据方程（1）计算。其中ODi表示电泳距离i处的光密度，Li表示电泳距离i处的估计分子量。用于TL测量的i范围（分析窗口）因研究人员和目标物种而异。遵循Pauliny等人的研究，本研究的范围设定在拖尾上限对应的21.2 kb和下限对应的7.4 kb之间。计算TL后，计算凝胶内和凝胶间的变异系数（CV）以评估技术误差。遵循Watson等人的方法，两个凝胶内CV值超过5%的样本被排除在进一步分析之外。其余55个样本的估计测量误差显示，平均凝胶间CV值为1.87%（范围：0.08–3.85），平均凝胶内CV值为0.97%（范围：0.002–4.78）。
氧化应激测量
测量血浆中的活性氧代谢物（d-ROMs）和生物抗氧化潜能（BAP）以量化氧化应激。使用Free Carrio Duo分析仪，用d-ROMs测试试剂盒（测量范围：40–1000 U.CARR；1 U.CARR对应于0.08 mg H2O2/dL的氧化能力）对来自41只个体的50个样本进行d-ROMs定量。使用BAP测试试剂盒（测量范围：500–6000 μM）对来自39只个体的46个样本测量BAP。血浆样本在分析前立即解冻，短暂涡旋，并在测量前于4°C下以15,000 rpm离心10分钟，遵循d-ROMs和BAP测试试剂盒方案。所有实验在样品温度低于10°C的条件下进行。因血浆浊度无法测量的浑浊血浆样本被排除在后续分析之外。
白细胞中淋巴细胞比例的测量
使用兽医多参数自动血液学分析仪或全自动血液学分析仪，对来自9只个体（5只宽吻海豚、1只白鲸、1只斑海豹和2只南美海狮）的13个样本测量白细胞分类计数。仅包括获得足够血液体积以进行白细胞分类分析的样本。使用样本获取水族馆安装的设备进行测量。分析原理涉及通过直流检测或DNA染色激光多角度偏振光散射分离细胞，从而根据细胞特性识别细胞类型。
统计分析
使用R进行统计分析和图形生成，并使用ggplot2和dplyr包生成图形。为确保描述性比较覆盖最广泛的物种范围，我们纳入了所有可用样本（N = 42），即使那些在血液采集和生物标志物测量之间存在延迟处理的样本。然而，对于后续的贝叶斯回归分析和测量值比较，仅使用保存延迟最小的样本（N = 34），以避免样本降解可能导致的偏差。
为了评估鲸豚类和鳍足类之间在TL、d-ROMs和BAP方面的差异，使用R中的brms包拟合贝叶斯线性模型。每个响应变量被建模为分类群（两个水平：鲸豚类和鳍足类）的函数，假设高斯误差分布和弱信息先验。生成单独的贝叶斯线性回归模型来检查年龄、d-ROMs、BAP和淋巴细胞比例对TL的影响。每个预测变量独立分析以避免因缺失值导致的样本量减少。构建了一个额外的贝叶斯模型来评估TL与样本保存持续时间（定义为DNA提取和Southern印迹分析之间的天数，以下简称“保存期”）之间的关系。所有模型运行四个马尔可夫链蒙特卡罗（MCMC）链，每个链包含4000次迭代，包括1000次预热迭代。计算所有固定效应的后验估计和95%可信区间，并使用R?值和有效样本量评估模型收敛性。
伦理批准、数据可用性、AI使用
血液采样由各水族馆附属的兽医根据日本动物园水族馆协会（JAZA）制定的伦理和福利指南进行。后续实验在水族馆提供的血液样本的大学实验室中进行。实验遵守京都大学动物实验委员会批准的研究方案（批准号：Inf-K21008, I-202202, I-202302）。
本研究期间生成和/或分析的数据集可向通讯作者合理索取。在准备本手稿期间，使用了生成式AI工具（ChatGPT-4o, OpenAI）协助英语语言编辑，并通过帮助识别函数和解决编码错误来支持R编程。未使用AI工具生成和解释科学数据。
结果
通过Southern印迹杂交法测量了TL。在所有来自6种鲸豚类的26只个体和来自6种鳍足类的16只个体中，均观察到拖尾信号，范围从分子量标记的大约21.2 kb（上端）到7.4 kb（下端）。使用方程（1）计算的TL值范围在12.1至14.6 kb之间，物种特异性平均值范围从12.6至13.9 kb。
d-ROMs和BAP值范围分别为26.5至279.0 U.CARR和1769至6100 μM。物种特异性平均值变化广泛，d-ROMs范围从51.3至247.0 U.CARR，BAP范围从2235至6100 μM。对于d-ROMs，一只白斑鼠海豚个体的值为26.5 U.CARR，一只白鲸的单次测量结果为26.0 U.CARR，两者均低于40 U.CARR的检测下限。关于BAP，一只白斑鼠海豚超出6000 μM的检测上限，测量值为6100 μM。在来自4个物种（5只宽吻海豚、1只白鲸、1只斑海豹和2只南美海狮）的9只个体（13个样本）中，白细胞中淋巴细胞比例范围从17.1%到46.5%。
数据显示，TL、d-ROMs、BAP和淋巴细胞比例的数据分布在鲸豚类和鳍足类之间仅有微小差异。一致地，贝叶斯线性模型显示这些指标没有统计学意义上的差异，因为所有分类群水平对比的95%可信区间都包含零。对于TL，鲸豚类的估计平均值（13.00 ± 0.40 kb）略高于鳍足类（12.20 ± 0.45 kb），后验平均差为-0.80 kb（95% CI：-1.88 至 0.25）。对于d-ROMs（+6.5 U.CARR, 95% CI: -16.4 至 29.3）、BAP（-127.4 μM, 95% CI: -779.7 至 517.0）和淋巴细胞比例（+10.5%, 95% CI: -4.2 至 25.3），相对于鲸豚类也观察到类似的不显著差异。
由于前述分析中未检测到两个类群之间的显著差异，因此将两个类群的数据合并，使用贝叶斯线性回归模型进行进一步分析。分别拟合模型以评估每个生理或人口统计学变量对TL的影响。年龄与TL呈负相关，尽管95% CI略微与零重叠（后验平均值：-0.02 kb/年，95% CI：-0.04 至 0.00）。d-ROMs、BAP和淋巴细胞比例未显示统计学意义上的关联，因为它们的95% CI包含零。最后，保存期（DNA提取和Southern印迹分析之间的标准化天数）对TL的影响估计为-0.03（95% CI：-0.08 至 0.02），表明未检测到关联。
讨论
本研究首次将Southern印迹杂交法应用于常用血液样本类型，测量了12种海洋哺乳动物42只个体的TL。血液样本包含不同年龄的细胞，并且单个染色体末端的TL不同。本研究中TL测量的变异系数（CV）较低（平均凝胶间CV = 1.87%，凝胶内CV = 0.97%），可能反映了在所有程序中使用一致的实验室、设备、试剂和单一实验员。然而，由于方案和实验室条件的差异，潜在的研究间变异仍然是端粒研究中的一个普遍关注点。因此，在比较不同研究的TL值时，识别和解释可能的方法学异质性非常重要。
我们的研究结果显示，6种鲸豚类（26只个体）和6种鳍足类（16只个体）的平均TL范围大约在12至15 kb之间。通常，TL在物种间差异很大。例如，人类TL范围在5至15 kb，而小鼠大约为50 kb。对60种哺乳动物的回顾发现，大型长寿物种通常表现出小于20 kb的TL，而小型短寿物种通常超过20 kb，反映了端粒酶活性的差异。本研究中分析的海洋哺乳动物体型大且寿命长（虎鲸寿命可达90年，南美毛皮海豹可达29年）。它们大约12–15 kb的TL，与先前关于TL和寿命关系的研究结果一致。
据我们所知，本研究首次全面分析了12种海洋哺乳动物血浆中的氧化应激标志物（d-ROMs和BAP）（不包括象海豹）。关于氧化应激，先前一项关于圈养陆地哺乳动物的研究报告称，拉布拉多犬的平均d-ROMs水平为73.9 ± 8.78 U.CARR（范围：56.4–91.4），平均BAP水平为2446 ± 585 μM（范围：1440–3260）。这些结果表明，海洋哺乳动物表现出比陆地食肉动物略高的d-ROMs和BAP水平。海洋和陆地哺乳动物的呼吸生理学存在显著差异。在潜水期间，它们完全停止呼吸，并通过喷水孔或嘴在水面快速吸气和呼气。这种涉及缺血和再灌注的独特呼吸模式可能使它们暴露于比陆地哺乳动物更高水平的氧化应激。值得注意的是，在少数个体中观察到的氧化应激值升高与样本处理延迟（即采集后超过1天分析的样本）并不重合。这表明处理延迟不太可能解释这些异常值。然而，考虑到保存延迟对生物标志物值的潜在影响，我们在除物种水平比较外的所有分析中排除了此类延迟样本。
当比较鲸豚类和鳍足类之间的四个生理指标时，仅观察到细微差异。贝叶斯线性模型显示没有统计学意义的分类群水平差异，因为所有95%可信区间都与零重叠。这些结果表明，观察到的组间变异可能反映了个体变异性而非系统性差异。然而，所有指标中组水平对比的一致方向（鲸豚类倾向于表现出略高的TL和较低的氧化应激）提出了分类群特异性生理特征的可能性。同样值得注意的是，缺乏统计学意义并不一定意味着缺乏生物学相关性。由于几个物种的样本量有限，特别是淋巴细胞比例，需要更大、更平衡的数据集进行进一步研究。
在所检查的个体水平预测因子中，年龄与TL呈显著负相关，这与端粒随年龄增长而缩短的充分记录模式一致。未发现TL与d-ROMs、BAP或淋巴细胞比例之间存在统计学意义上的关系。这些无效结果可能仅仅归因于可用样本量下的统计功效有限。或者，它可能反映了端粒动力学、氧化应激和免疫状态之间复杂且依赖于背景的相互作用。d-ROMs增加表明ROS升高，可能促进端粒缩短，因为氧化损伤更容易在端粒DNA中积累并加速其丢失。
在鸟类中，TL主要在红细胞中测量，而在哺乳动物（包括本研究中的动物）中，TL在白细胞中测量。白细胞群中淋巴细胞比例的变化（通常具有较长的端粒）会影响个体TL。在本研究中，未发现TL与白细胞中淋巴细胞比例之间存在显著相关性，可能反映了小样本量或端粒酶活性的种间变异。需要进一步研究来验证这些发现。未来的研究应全面探索端粒酶活性与氧化应激之间的关系。
重要的是，保存期（DNA提取和Southern印迹分析之间的标准化天数）与TL无关，表明此处使用的储存方法未可测量地影响DNA完整性。虽然最佳实践指南建议在-80°C储存，但本研究的储存温度为-30°C，符合相关文献和试剂盒制造商建议。此外，已证明即使对于在本实验中使用的高浓度样本在-30°C储存6个月，TL测量也是可行的。然而，我们承认与样本处理或储存条件相关的未测量因素可能引入变异性，应在未来研究中加以考虑。
最后，认识到圈养对本研究评估的生理指标的潜在影响非常重要。在圈养动物中，因素如不平衡喂养、有限的围栏空间、社会行为以及这些条件导致的应激可能影响氧化应激。因此，从圈养个体获得的值可能不能完全反映野生种群的值。未来纳入野生个体的研究对于澄清物种或分类群特异性生理基线以及评估这些标志物在自然条件下的生态和保护相关性至关重要。
总之，本研究首次成功使用Southern印迹杂交法测量了12种圈养海洋哺乳动物42只个体血液中的TL。使用跨相同组织类型样本的标准化方法获得了基本物种特异性信息，如TL和个体变异。这些结果为理解鲸豚类和鳍足类的TL和氧化应激提供了关键基线。
本研究的局限性包括每个物种的样本量相对较小、冷冻储存温度并非最佳，以及仅关注圈养个体，这可能影响研究结果的普适性。需要未来更大、更多样化的样本研究来验证这些结果。采用TL测量的最佳实践、最小化样本收集和分析之间的时间、以及在更低的温度下储存样本也很重要。此外，由于本研究是横断面性质的，它在直接评估个体端粒缩短速率方面存在固有局限性。未来对相同个体进行纵向监测对于更稳健地理解端粒动力学至关重要。
由于样本采集的挑战，对海洋哺乳动物的生理学研究落后于陆地物种。尽管如此，本研究的结果增强了我们对端粒普遍功能及其进化意义的理解。此外，这项工作有助于研究海洋哺乳动物的急性和慢性应激，并有助于为应用TL作为个体水平生物标志物奠定基础。
