《HemaSphere》：Highly effective combination of BRG1/BRM inhibitor with BET inhibitor or decitabine for high-risk MECOM-rearranged AML
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本研究聚焦于具有3q26.2重排（MECOM重排）的高危急性髓系白血病（AML），探讨了选择性BRG1（SMARCA4）/BRM（SMARCA2）ATP酶抑制剂FHD-286单用及与BET抑制剂（BETi）、地西他滨（DAC）或组蛋白乙酰转移酶（HAT）抑制剂联用的疗效。研究证实FHD-286可诱导MECOM-r AML细胞分化、凋亡，并伴随EVI1、c-Myc等关键癌蛋白表达下调。联合方案在体外及患者来源异种移植（PDX）模型中均展现出协同抗白血病活性，显著降低肿瘤负荷并延长生存期，为这类预后极差的AML患者提供了新的治疗希望。
引言
急性髓系白血病（AML）中涉及染色体3q26.2的重排，如inv(3)(q21q26.2)或t(3;3)(q21;q26.2)，虽然罕见（约占新诊断AML的1%），但临床预后极差。这类重排导致远端GATA2造血增强子的异常易位，进而激活MECOM基因座上的EVI1表达。EVI1是一个转录调节因子，在AML的增殖、抑制髓系分化和维持干细胞样表型中发挥关键作用。目前，针对MECOM重排AML的有效治疗方案有限，因此开发新的靶向疗法以抑制EVI1表达、改善患者生存是亟待解决的临床需求。
BRG1（SMARCA4）和BRM（SMARCA2）是BAF染色质重塑复合物中相互排斥的核心ATP酶，它们通过调节增强子/启动子的可及性和基因表达，在AML干细胞/祖细胞的增殖和分化中扮演重要角色。FHD-286是一种口服生物可利用的选择性BRG1/BRM抑制剂，目前正处于AML的早期临床试验阶段（NCT04891757）。先前的研究表明，FHD-286在伴有MLL1重排（MLL1r）或突变NPM1（mtNPM1）的AML细胞中能诱导分化和致死效应。本研究旨在深入探讨FHD-286在MECOM重排AML中的体外和体内疗效及其分子机制。
材料与方法
研究使用了包括UCSD-AML1、患者来源的MECOM-r AML细胞系（如AML191、AML194等）以及MUTZ3-EVI1-GFP报告细胞系。关键试剂FHD-286由Foghorn Therapeutics提供，地西他滨和OTX015购自MedChem Express。细胞活力通过TO-PRO-3碘化物染色流式细胞术检测，协同作用使用SynergyFinder V3在线工具的ZIP方法评估。研究还综合运用了ChIP-Seq（检测BRG1、H3K27Ac occupancy）、ATAC-Seq（分析染色质可及性）、RNA-Seq（转录组分析）、质谱蛋白质组学、免疫印迹以及单细胞质谱流式（CyTOF）等技术。体内疗效在免疫缺陷NSG小鼠构建的MECOM-r AML患者来源异种移植（PDX）模型中进行评估。测序数据已存入GEO数据库。
结果
MECOM重排AML细胞对FHD-286诱导的分化和致死作用敏感
对BEAT AML2.0数据集的分析显示，MECOM重排AML样本（约2%）的EVI1和SMARCA2（BRM）mRNA表达显著高于非MECOM重排AML样本。免疫印迹证实多种MECOM-r AML细胞系和患者样本表达不同水平和亚型的BRG1和BRM蛋白。体外实验表明，低浓度（10-30 nM）FHD-286处理7天可诱导MECOM-r AML细胞（如AML191、AML194等）表达分化标志物CD11b或CD14，并呈现髓系分化形态特征，同时伴随细胞活力丧失。较高浓度（最高250 nM）的FHD-286处理96小时能剂量依赖性地诱导细胞死亡。将FHD-286处理后的CD11b+细胞分选出来并在无药培养基中继续培养，这些细胞表现出更高的分化水平和细胞死亡。FHD-286对患者来源的MECOM-r AML原代细胞同样有效，且对正常CD34+祖细胞毒性较小。
FHD-286对MECOM-r AML细胞中BRG1占据、H3K27Ac修饰、超级增强子及核心调控环路的影响
ChIP-Seq分析显示，FHD-286处理显著降低了AML242细胞中BRG1在全基因组的占据，并改变了其在启动子和增强子上的分布。这伴随着关键转录因子（如ETS1、PU.1（SPI1）、SPIB、ERG、MYB）在BRG1占据减少位点的结合下降。特别值得注意的是，FHD-286降低了BRG1在MECOM、MYC、CSF1R等与细胞生长相关基因位点的占据，同时增加了在CDKN1B、GFI1B、BBC3（PUMA）、PMAIP1（NOXA）等与应激反应、生长停滞或凋亡相关基因位点的占据。FHD-286处理还降低了位于驱动MECOM表达的易位GATA2增强子和3q21超级增强子上的BRG1和H3K27Ac占据。超级增强子（ROSE）分析表明，FHD-286导致MYC、PIM1、BCL2、SPI1和CDK6等基因的超级增强子H3K27Ac峰密度降低，而GFI1、JUND、RUNX1、MYB等基因的超级增强子排名升高。核心调控环路（CRC）分析显示，FHD-286处理后CRC评分降低，参与的主要调控因子数量减少，且特定转录调节因子（如WT1、HOXC9、IRF4、RXRA、CEBPA）的活性丧失，同时出现了一些新的调控因子活性。
在AML191细胞中，ATAC-Seq和H3K27Ac ChIP-Seq分析得到了类似的结果，FHD-286处理改变了染色质可及性和增强子景观，并影响了CRC。此外，FHD-286处理导致与分化和/或凋亡相关基因（如ATF4、BAK、BAX、BBC3、BCL2L11（BIM）、CDKN1A、CDNK1B、PMAIP1）启动子区域的H3K27Ac占据显著增加。
FHD-286对MECOM-r AML细胞染色质可及性和转录组的影响
RNA-Seq分析显示，FHD-286处理引起了AML242和AML191细胞中广泛的基因表达变化，与BRG1占据和H3K27Ac修饰的变化相吻合。基因集富集分析（GSEA）表明，FHD-286处理负向富集了MYC靶标、mTORC1信号、炎症反应等通路。FHD-286显著降低了MYC、SPI1、IRF8、IL7R、KIT、CD180、CD44、CSF1R、MECOM（EVI1）等BRG1/BRM靶基因的mRNA表达，同时增加了HEXIM1、CDKN1A、FBXO32、GATA2、BCL2L11等基因的表达。重要的是，FHD-286处理还导致EVI1靶基因的显著下调。在MUTZ3-EVI1-GFP报告细胞中，FHD-286剂量依赖性地降低了GFP荧光强度，表明其能抑制EVI1的表达。ATAC-Seq和RNA-Seq的联合分析揭示了在染色质可及性和基因表达水平上的一致性变化。尽管FHD-286诱导了形态学分化，但转录组分析并未显示出与之前在其他AML亚型中报道的完全相同的全局分化签名。
FHD-286介导的蛋白质表达改变包括EVI1、c-Myc和PU.1
质谱蛋白质组学分析揭示了FHD-286处理AML191、AML194和UCSD-AML1细胞后蛋白质表达的显著变化。研究发现RNA和蛋白质水平的表达变化具有高度一致性。FHD-286处理导致EVI1、c-Myc、BCL2、CD44、CDK4、CSF1R、CD34、MPO等蛋白表达下调，而ITGAM、CTTN、CDKN1A、CD47等蛋白表达上调。三种细胞系中共同下调的蛋白有175种，共同上调的有108种。免疫印迹分析进一步证实，FHD-286处理能时间依赖性和剂量依赖性地降低EVI1、c-Myc、BCL2、CDK6等蛋白水平，同时增加p21、p27和CD11b的表达。
利用CyTOF技术对6例MECOM-r AML患者样本的表型确定的AML干细胞（高表达CLEC12A、CD123、CD99、CD33，低表达CD11b）进行分析发现，FHD-286处理显著降低了这些干细胞中CD34、PU.1、EVI1和c-Myc的蛋白表达，不同程度地增加了BIM、cleaved PARP、CD47和p53的表达。更重要的是，FHD-286处理降低了7例MECOM-r AML样本中6例的表型干细胞频率。
FHD-286与地西他滨、BET抑制剂或HAT抑制剂联合在MECOM-r AML中的卓越体外疗效
在UCSD-AML1细胞中进行的针对表观遗传调节蛋白的CRISPR筛选提示，BRD4和EP300的sgRNA在FHD-286存在下富集，可能成为潜在的耐药机制。与此一致，FHD-286与BET抑制剂OTX015或地西他滨联合处理MUTZ3-EVI1-GFP细胞，能更有效地抑制EVI1/GFP报告基因活性。体外协同杀伤实验表明，FHD-286与地西他滨或OTX015联合，在患者来源的MECOM-r AML细胞（n=7）中产生了协同致死效应（ZIP协同得分>3.9）。这种协同作用伴随着EVI1、c-Myc、c-Myb、BCL2蛋白的更显著耗竭以及HEXIM1、HMOX1、p21、p27蛋白的诱导。此外，FHD-286与高选择性CBP/p300溴结构域抑制剂GNE-781联合，或在MECOM-r AML细胞系和原代细胞中与双功能BET/HAT抑制剂NEO2734/EP31670联合，也显示出协同杀伤作用。
FHD-286与BET抑制剂联合在MECOM-r AML中的卓越体内疗效
在MECOM-r AML的PDX模型（如AML425、AML191、AML251、AML194）中评估了FHD-286单用及联合用药的体内疗效。虽然FHD-286单药治疗能在一定程度上减少AML425模型小鼠骨髓和肝脏中的白血病负荷并诱导CD11b表达，但由于该模型侵袭性强，未能显著改善生存期。在AML191 flank模型中，FHD-286与地西他滨联合比单药更能抑制肿瘤生长。在更为关键的AML251和AML194 luciferized PDX模型中，与 Vehicle 对照或FHD-286、OTX015单药治疗相比，FHD-286与OTX015联合治疗能显著降低白血病负荷，并显著延长NSG小鼠的生存期。这些结果突显了FHD-286基于联合疗法在侵袭性MECOM-r AML模型中的卓越体内疗效。
讨论
本研究证实，MECOM重排AML细胞依赖于BRG1/BRM的活性。FHD-286通过抑制BRG1/BRM ATP酶活性，引起广泛的染色质重塑、转录组和蛋白质组扰动，特别是抑制了EVI1的表达，从而克服分化阻滞，诱导MECOM-r AML细胞分化和死亡。其作用机制涉及破坏核心调控环路，影响超级增强子活性，以及下调MYC、BCL2等关键促生存信号。更重要的是，FHD-286与地西他滨或BET抑制剂等药物在体外和体内均展现出协同抗白血病活性，这为克服潜在耐药、提高疗效提供了策略。蛋白质组学和CyTOF分析进一步揭示了FHD-286对MECOM-r AML干细胞/祖细胞的特异性影响，表明其能靶向白血病起始细胞。
综上所述，本研究结果表明，FHD-286单药及其与标准疗法（如地西他滨）或新型靶向药物（如BET抑制剂）的联合使用，是针对高危MECOM重排AML的一种极具前景的治疗策略。这些临床前发现为后续临床试验的设计提供了坚实的理论基础和实验依据。
