《MEDIATORS OF INFLAMMATION》：Synergistic Alleviation of Inflammatory Cytokine Storms in Sepsis Rats by Low-Intensity Pulsed Ultrasound and Imipenem
摘要
本研究旨在探讨低强度脉冲超声（LIPUS）联合亚胺培南（IMI）对脓毒症大鼠炎症反应及器官保护的影响。研究纳入230只Sprague-Dawley（SD）大鼠，其中80只用于生存分析，150只用于72小时内的样本采集。组织学检查（苏木精-伊红（H&E）染色）和透射电子显微镜（TEM）结果显示，LIPUS联合IMI显著减轻了脾脏组织损伤和线粒体水肿。关键炎症细胞因子，如白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和IL-6在LIPUS+IMI组显著降低，而IL-10水平升高（p < 0.05）。联合治疗还降低了IL-1受体（IL-1R）、核因子κB p65（NF-κB p65）、转化生长因子-β（TGF-β）和高迁移率族蛋白B1（HMGB1）等细胞因子的表达，表明炎症减轻（p < 0.05）。本研究提出了一种整合LIPUS与IMI的新方法，为缓解脓毒症中的细胞因子风暴、优化抗生素使用和减少器官损伤提供了一种非侵入性且有效的策略。观察到的保护作用主要归因于对IL-1R/NF-κB信号通路的抑制，从而显著改善脓毒症大鼠的生存结局。这种联合疗法有潜力优化脓毒症治疗方案。
1. 引言
根据最新的“脓毒症-3”共识定义，脓毒症是宿主对感染的反应失调引起的危及生命的器官功能障碍。脓毒症病理生理学的一个标志是其双相免疫反应，其特征是过度的促炎性“细胞因子风暴”和随后的免疫抑制，这破坏了肾脏、肝脏、肺和心脏等重要器官的生理稳态，最终导致多器官功能障碍综合征（MODS）。MODS是ICU患者死亡的主要原因。
脓毒症的病理过程涉及复杂的炎症反应，细胞因子风暴是关键机制。细胞因子风暴是指感染后免疫系统的过度激活，导致各种炎症细胞因子的大量释放，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β和IL-6。然而，脓毒症的紧急性往往阻碍了抗生素的最佳选择和剂量确定，这可能会增加治疗期间不良事件、器官功能障碍甚至死亡的风险。
抗生素治疗仍然是脓毒症管理的基石，及时给药可以显著降低发病率和死亡率。亚胺培南（IMI）是一种广谱β-内酰胺类抗生素，在临床实践中广泛使用，并已被证明能在脓毒症模型中减少IL-6和TNF-α等炎症细胞因子。在实践中，IMI每6-8小时给药一次。然而，其长期或过量使用会破坏免疫稳态并引起器官毒性，这凸显了在最小化不良反应的同时优化抗生素疗效的策略的必要性。
低强度脉冲超声（LIPUS）是一种非侵入性物理疗法，具有非侵入性、便携性和强靶向能力等多项优势。LIPUS主要依靠非热机械效应影响细胞信号通路，包括NF-κB和MAPK，从而抑制炎症反应。重要的是，靶向脾脏的LIPUS可能调节全身免疫活性，因为脾脏在脓毒症期间平衡炎症和免疫抑制中起着核心作用。我们先前的研究进一步证明，对脓毒症大鼠脾脏进行LIPUS照射可显著降低IL-1β和TNF-α水平并提高存活率。其低成本和低风险使LIPUS成为炎症性疾病中有前景的辅助疗法。基于这些发现，我们假设LIPUS和IMI的联合应用可以通过抑制过度的促炎细胞因子释放同时缓解随后的免疫抑制，从而协同调节脓毒症中失调的免疫反应。本研究旨在评估LIPUS联合IMI对脓毒症大鼠生存率、细胞因子风暴调节和器官保护的影响，并探索潜在的机制。鉴于脓毒症的全球负担，特别是在资源有限地区，本研究可能为开发非侵入性、成本效益高的辅助疗法奠定基础。
2. 结果
2.1. IMI的给药时机
我们的研究揭示了实验组之间降钙素原（PCT）和C反应蛋白（CRP）水平的显著差异。在CLP组，PCT水平呈现持续上升趋势，在24小时达到峰值。相比之下，LIPUS组在4、8、16、24、48和72小时的PCT水平显著低于CLP组（p < 0.05）。类似地，CLP组的CRP水平持续增加，在48小时达到最大值。然而，LIPUS组在所有检测时间点（4-72小时）的CRP水平均显著低于CLP组（p < 0.05）。这些发现表明LIPUS可以在4-72小时的时间范围内有效调节炎症。基于这些观察，我们制定了优化的IMI临床给药方案：两个剂量，每24小时给药一次，首次剂量在CLP手术后1小时给予。
2.2. LIPUS联合IMI对72小时生存率的影响
脓毒症模型成功建立的指标包括运动减少、嗜睡、寒战和竖毛。在IMI组，16只大鼠中有5只在72小时内存活，生存率为31.25%，生存时间为37.75 ± 26.45小时。LIPUS组有7只存活，生存率为43.75%，生存时间为43.75 ± 27.23小时。联合治疗组（LIPUS+IMI）的生存率最高，16只大鼠中有10只存活（62.50%），生存时间为58.00 ± 20.55小时。CLP组的所有大鼠在72小时内死亡，生存时间为17.50 ± 11.58小时，而假手术组的所有大鼠在整个72小时期间均存活。与CLP组相比，IMI组和LIPUS组均显著提高了生存率。值得注意的是，与单独使用IMI组相比，LIPUS+IMI组的生存率（p < 0.05）和生存时间（p < 0.05）均有显著改善。
2.3. LIPUS联合IMI对脾脏组织病理学的影响
CLP组脾脏组织的白髓和红髓边界不清，有明显的炎性细胞浸润。相比之下，LIPUS组、IMI组和LIPUS+IMI组脾脏的白髓和红髓分界更为清晰，炎性细胞浸润减少。假手术组显示正常的白髓和红髓结构。
2.4. LIPUS联合IMI对脾脏超微结构的影响
CLP组表现出线粒体水肿（绿色箭头指示）、内质网扩张（蓝色箭头指示）和核周隙扩张。然而，在LIPUS组、IMI组和LIPUS+IMI组中，观察到线粒体水肿的缓解（红色箭头指示）。值得注意的是，假手术组的脾脏超微结构保持正常。
2.5. LIPUS联合IMI对血清和脾脏细胞因子水平的影响
2.5.1. 血清细胞因子水平
在8、24、48和72小时，LIPUS组、IMI组和LIPUS+IMI组的血清IL-1β水平显著低于CLP组（p < 0.05）。在治疗后4、8、16、24、48和72小时，LIPUS组、IMI组和LIPUS+IMI组的血清TNF-α水平显著低于CLP组（p < 0.05）。此外，在除48小时外的所有时间点，IMI组和LIPUS+IMI组的TNF-α水平均显著低于单独LIPUS组（p < 0.05）。在所有测量时间点（4-72小时），LIPUS组和IMI组的血清IL-6水平显著低于CLP组（p < 0.05）。此外，从16到72小时，LIPUS+IMI组的IL-6水平降低幅度显著大于单独IMI组（p < 0.05）。
在4、16和48小时，LIPUS组、IMI组和LIPUS+IMI组的血清HMGB1水平显著低于CLP组（p < 0.05）。此外，在8、16、24和72小时，LIPUS+IMI组的HMGB1水平显著低于单独LIPUS组（p < 0.05）。在16、24、48和72小时，LIPUS组和IMI组的血清TGF-β水平显著低于CLP组（p < 0.05）。在24小时，LIPUS+IMI组的TGF-β水平显著低于单独IMI组（p < 0.05）。在4、8和48小时，LIPUS+IMI组的血清IL-10水平显著高于CLP组（p < 0.05）。
2.5.2. 脾脏细胞因子水平
在所有时间点（4-72小时），LIPUS组、IMI组和LIPUS+IMI组的脾脏IL-1β水平显著低于CLP组（p < 0.05）。此外，在24小时，LIPUS组和LIPUS+IMI组的IL-1β水平显著低于IMI组（p < 0.05）。在4、8、16、24和48小时，LIPUS组、IMI组和LIPUS+IMI组的脾脏TNF-α水平显著低于CLP组（p < 0.05）。在16、24、48和72小时，LIPUS组和LIPUS+IMI组的TNF-α水平显著低于IMI组（p < 0.05）。
在4、8、24、48和72小时，LIPUS组、IMI组和LIPUS+IMI组的脾脏IL-6水平显著低于CLP组（p < 0.05）。在4、16和24小时，LIPUS+IMI组的IL-6水平显著低于IMI组（p < 0.05）。在所有时间点（4-72小时），LIPUS组、IMI组和LIPUS+IMI组的脾脏HMGB1水平显著低于CLP组（p < 0.05）。在8、16、24、48和72小时，LIPUS+IMI组的HMGB1水平显著低于IMI组（p < 0.05）。
在4、8、16、24和72小时，LIPUS组、IMI组和LIPUS+IMI组的脾脏TGF-β水平显著低于CLP组（p < 0.05）。在8和24小时，LIPUS+IMI组的TGF-β水平显著低于IMI组（p < 0.05）。在4、8、16、24、48和72小时，LIPUS组、IMI组和LIPUS+IMI组的脾脏IL-10水平显著高于CLP组（p < 0.05）。此外，在16、48和72小时，LIPUS+IMI组的IL-10水平显著高于IMI组（p < 0.05）。
2.6. 细胞因子水平的免疫组织化学分析
在4、16、24、48和72小时，LIPUS组、IMI组和LIPUS+IMI组脾脏中TNF-α的表达水平显著低于CLP组（p < 0.05）。在8、16、48和72小时（p < 0.05），LIPUS+IMI组脾脏中TNF-α的表达显著低于IMI组。此外，在24小时（p < 0.05），LIPUS+IMI组脾脏中TNF-α的表达显著低于LIPUS组。在上述时间点，LIPUS+IMI组脾脏中NF-κB p65的表达水平显著低于LIPUS组和IMI组（p < 0.05）。在4、8、16、24、48和72小时，LIPUS组、IMI组和LIPUS+IMI组脾脏中IL-1β的表达水平显著低于CLP组（p < 0.05）。在这些时间点以及治疗后24小时，LIPUS+IMI组脾脏中IL-1β的表达水平显著低于LIPUS组和IMI组（p < 0.05），特别是在治疗后24小时，LIPUS+IMI组与IMI组之间存在显著差异（p < 0.05）。在治疗开始后4、16、24、48和72小时，LIPUS组、IMI组和LIPUS+IMI组脾脏中IL-6的表达水平显著低于CLP组（p < 0.05）。
在4和8小时，LIPUS+IMI组脾脏中IL-6的表达水平显著低于LIPUS组（p < 0.05）。在16、24和72小时，LIPUS+IMI组脾脏中IL-6的表达水平显著低于LIPUS组和IMI组（p < 0.05）。在48小时，LIPUS组和LIPUS+IMI组脾脏中IL-6的表达水平显著低于IMI组（p < 0.05）。在16、24、48和72小时，LIPUS组、IMI组和LIPUS+IMI组脾脏中IL-10的表达水平显著高于CLP组（p < 0.05）。在4、8、16和48小时，LIPUS组和LIPUS+IMI组脾脏中IL-10的表达水平显著高于IMI组（p < 0.05）。在24小时，LIPUS+IMI组脾脏中IL-10的表达水平显著高于LIPUS组和IMI组（p < 0.05）。
2.7. 炎症细胞因子的相对mRNA表达水平
LIPUS组、IMI组和LIPUS+IMI组脾脏中TNF-α、IL-1β、IL-6和TGF-β的mRNA表达水平显著低于CLP组（p < 0.05），并且LIPUS+IMI组脾脏中TNF-α、IL-1β和TGF-β的mRNA表达水平显著低于LIPUS组和IMI组（p < 0.05）。LIPUS+IMI组IL-6 mRNA的表达水平显著低于LIPUS组（p < 0.05）。LIPUS组和LIPUS+IMI组IL-10 mRNA的表达水平显著高于CLP组（p < 0.05），并且LIPUS+IMI组IL-10 mRNA的表达水平显著高于LIPUS组和IMI组（p < 0.05）。
2.8. LIPUS联合IMI对其他器官的影响
假手术组的心脏、肝脏、肺、肾脏和卵巢表现出正常的结构和形态特征。相比之下，CLP组表现出了一系列病理改变：心脏心肌细胞肿胀、肌原纤维排列紊乱和间质间隙增宽；肝脏肝细胞形态紊乱、肝窦内红细胞积聚和巨噬细胞增多；肺间质水肿、肺泡壁增厚、肺泡充血和炎性细胞浸润；肾脏肾小管上皮细胞坏死脱落和肾间质充血；卵巢间质水肿和闭锁卵泡增加。值得注意的是，在LIPUS组、IMI组和LIPUS+IMI组中，这些器官未观察到显著损伤。
假手术组的心脏、肝脏、肺、肾脏和卵巢的超微结构完整性保持正常。相比之下，CLP组表现出了一系列超微结构改变：心脏组织中线粒体排列紊乱和肌丝破坏；肝细胞中粗面内质网包裹线粒体、细胞质水肿和核周隙扩张；肺中I型肺泡细胞水肿和肺毛细血管腔内白细胞阻塞；肾组织中线粒体肿胀和系膜增厚；卵巢细胞中线粒体肿胀和自噬证据。值得注意的是，在LIPUS组、IMI组和LIPUS+IMI组的心脏、肝脏、肺、肾脏和卵巢中未观察到显著的超微结构异常，表明联合治疗有效减轻了脓毒症诱导的器官损伤。
3. 讨论
在本研究中，我们评估了这种联合疗法对脓毒症大鼠治疗结果的潜在增强作用。结果表明，同时接受LIPUS和IMI治疗的大鼠在72小时的生存率显著高于仅接受IMI治疗的大鼠。这些发现表明，观察到的改善可能与LIPUS的抗炎作用有关，这可能有助于改善治疗结果。
提高生存率是脓毒症管理的关键方面。在本研究中，LIPUS和IMI的联合应用显著提高了大鼠脓毒症后72小时内的生存率，突出了这种方法作为脓毒症新治疗选择的潜力。目前，早期给予抗生素已成为改善脓毒症治疗生存结局的广泛接受且生物学合理的临床策略。然而，即使抗生素治疗延迟1小时，也会导致脓毒症、严重脓毒症和脓毒性休克患者的死亡率绝对增加。尽管有益处，但过度或不适当使用抗生素也可能导致严重的安全后果，例如器官损伤。因此，在不影响疗效的情况下优化脓毒症患者的抗生素给药时机至关重要。IMI是一种广谱抗生素，能够抑制大多数革兰氏阴性菌、阳性菌和厌氧菌，被认为是一个理想的选择。国际拯救脓毒症运动建议早期识别脓毒症患者，并在疑似脓毒症和脓毒性休克后1小时内立即给予抗生素。因此，在本研究中，IMI在CLP手术后1小时首次给药。然而，后续给药的时机和频率比首次给药的时机更为关键。由于IMI化学不稳定，半衰期相对较短（约0.4天），在标准临床方案中通常每6-8小时给药一次，持续1-2周。然而，过度使用抗生素可能导致多器官功能障碍。先前的研究表明，LIPUS与IMI联合可能表现出协同抗炎作用，并且可能是早期脓毒症治疗的一种有前景的方法。PCT和CRP是脓毒症诊断中广泛使用的生物标志物，并且观察到在治疗后4至72小时，LIPUS组的表达水平低于CLP组，表明LIPUS在此期间可能具有抗炎作用。
细胞因子风暴是脓毒症生存的另一个关键决定因素。脓毒症是由宿主免疫反应和过度炎症引发的，导致促炎细胞因子如IL-1β、IL-6和TNF-α的释放。促炎细胞因子的过度产生可引发细胞因子风暴，这可能导致多器官功能障碍并最终导致死亡。先前的研究已证明，IL-6水平升高与CLP死亡率显著相关，这与本研究中的发现一致。我们在大鼠CLP模型成功建立后48小时测量到脾脏组织中IL-6水平达到峰值。因此，我们认为这也是所有组别大鼠在48小时内死亡率最高的原因。与早期炎症介质不同，HMGB1作为晚期炎症介质起着关键作用，能够激活细胞内NF-κB信号通路并加剧组织损伤；因此，它是预防和治疗晚期脓毒症的重要靶点。我们当前研究的结果支持这一观点。虽然IL-1β、TNF-α和IL-6在72小时内初始峰值后呈现下降趋势，暗示初始感染可能得到缓解，但HMGB1水平的变化轨迹不明显，甚至在脾脏中持续上升直至72小时。然而，LIPUS和IMI的联合治疗导致HMGB1水平显著降低，表明该干预措施可以减轻由HMGB1诱导的脓毒症的长期病理后果。因此，有效控制细胞因子风暴对于脓毒症患者的生存至关重要。在本研究中，LIPUS和IMI的联合疗法在CLP手术后4-72小时的时间范围内展示了潜在的抗炎机制，表明其能够减弱细胞因子风暴并提高生存率。需要进一步的研究来全面阐明潜在机制并探索该方法在管理脓毒症患者细胞因子风暴方面的全部潜力。
在先前的研究中，我们发现LIPUS通过抑制IL-1R/NF-κB信号通路从而减轻炎症，对脓毒症表现出保护作用。为了进一步研究LIPUS和IMI的联合是否也能通过IL-1R/NF-κB信号通路在脓毒症大鼠中产生有效的治疗，我们进行了额外的实验。结果表明，CLP组中TNF-α、IL-1R、IL-1β、IL-6和NF-κB p65的表达水平显著上调；然而，在LIPUS+IMI干预后，这些蛋白水平显著降低。因此，LIPUS联合IMI可能通过下调IL-1β表达和抑制NF-κB信号通路，在脓毒症早期发挥保护作用。然而，应注意这些结果是相关性的，需要进一步的功能验证来确认IL-1R/NF-κB信号通路在介导LIPUS联合IMI保护作用中的因果关系。值得注意的是，在LIPUS组、IMI组和LIPUS+IMI组中观察到IL-10水平升高。IL-10通常被认为是一种抗炎细胞因子，在脓毒症期间抑制过度免疫激活和组织损伤。IL-10升高有助于恢复免疫平衡并限制细胞因子风暴诱导的损伤。相反，HMGB1是一种普遍存在的核蛋白，在正常情况下参与转录调控。与早期炎症介质（如TNF-α）不同，HMGB1被认为是在细胞因子介导的脓毒症动物模型中导致致死性全身炎症的晚期介质。Ulloa等人已证明，丙酮酸乙酯可能通过调节NF-κB信号通路抑制早期和晚期炎症介质（TNF-α和HMGB1）的释放。我们的研究揭示了CLP诱导的脓毒症大鼠血清和脾脏中HMGB1水平的初始升高，而LIPUS和IMI的联合干预显著减弱了这种升高。此外，抑制TGF-β信号通路已被证明可以改善脓毒症相关的器官功能障碍并延长脓毒症小鼠的生存期。Pan等人先前的研究发现，用大承气汤治疗的脓毒症大鼠肝脏中TGF-β的表达水平显著降低，表明可能通过TGF-β/Smad3信号通路介导抗炎作用。与这些发现一致，我们的结果显示联合LIPUS和IMI干预后TGF-β蛋白表达显著降低，表明这种联合疗法显著提高了生存率，并具有减轻脓毒症大鼠炎症的潜力。
4. 局限性
本研究有几个局限性。首先，抗生素方案需要进一步优化，我们没有评估IMI的药代动力学或细菌清除情况，这限制了对机制的理解。其次，我们缺乏“非脾脏”LIPUS对照组（例如，照射侧腹区域），限制了对超声效应区域特异性的解释。第三，关于脾神经调节 underlying 保护效应的假设在没有直接神经调节证据的情况下仍然是推测性的；未来的研究需要结合神经通路阻断或电生理验证来阐明机制。第四，CLP前未进行脾切除术限制了直接评估脾脏在脓毒症进展中参与的能力。第五，LIPUS仅应用一次；重复或长期治疗可能引发不同的生物效应，值得进一步研究。第六，72小时的观察期可能低估了延迟死亡率和脓毒症的后期免疫抑制阶段。未来的研究将观察期延长至7天，并包括器官功能障碍的替代标志物，如ALT、肌酐和肺组织病理学评分，以增强转化价值。最后，尽管啮齿类动物CLP模型因其大小和取样方面的优势而被广泛使用，但它们可能无法完全捕捉人类脓毒症的异质性和复杂性，因此，将研究结果外推至临床环境时需要谨慎。未来的研究应侧重于大动物验证和LIPUS疗法在脓毒症条件下的临床可行性评估。
尽管我们当前的研究为LIPUS和IMI联合在减轻脓毒症大鼠炎症细胞因子风暴方面的有益作用提供了初步证据，但需要更大的样本量和更深入的机制研究来验证这些发现。未来的研究可能会探索LIPUS应用的最佳参数，并研究这种联合疗法对脓毒症器官功能和生存结局的长期影响。
5. 结论
总之，LIPUS和IMI的联合应用已被证明可通过抑制IL-1R/NF-κB信号通路从而减轻炎症，有效治疗脓毒症大鼠。本研究的结果提供了初步证据，表明这种联合疗法可以优化脓毒症治疗中抗生素的使用策略，减少器官损伤，并最终改善生存结局。总体而言，这些发现表明LIPUS联合IMI可能代表一种有前景的脓毒症治疗方法。
6. 材料与方法
6.1. 实验动物
研究使用了230只SPF级雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠，周龄6-8周，体重（200 ± 20）克，购自重庆医科大学实验动物中心（许可证号：SCXK [重庆] 2018-0003）。这些大鼠饲养在受控的SPF动物设施中，温度22 ± 2°C，湿度45% ± 5%，正常昼夜循环，自由获取标准饮食和水。
6.2. 脓毒症诱导与研究设计
适应期后，用异氟烷（诱导：约4%–5%，维持：约1.5%–2%，吸入）麻醉大鼠，并通过CLP诱导经典脓毒症模型。总共80只SD大鼠由一名不参与实验的研究人员使用随机数字表随机分配，然后分配到五组：CLP后立即LIPUS治疗（LIPUS组；n = 16）、IMI组（IMI组；n = 16）、LIPUS和IMI联合治疗组（LIPUS+IMI组；n = 16）、CLP诱导脓毒症无干预（CLP组；n = 16）和假手术对照组（Sham组；n = 16）。所有结果评估和数据分析由不知分组情况的研究人员进行。上述五组用于建模和治疗后72小时内的
