《Aggregate》：Anion-π+ Type AIE-Active Photosensitizers for Ferroptosis-Driven Photodynamic Immunotherapy Against Hypoxic Solid Tumors
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本文提出了一种利用阴离子-π+相互作用构建具有聚集诱导发光（AIE）特性的I型光敏剂（PSs）的新策略，以解决光动力免疫疗法（PDT-immunotherapy）在缺氧实体瘤治疗中面临的氧依赖性、凋亡抗性和免疫抑制肿瘤微环境（TME）等瓶颈。所开发的TMTPA纳米颗粒（NPs）在635 nm激光照射下，展现出优异的I型活性氧（ROS）生成能力和线粒体靶向性，可诱导脂质过氧化（LPO）积累并触发铁死亡（Ferroptosis），进而促进树突状细胞（DC）成熟和T细胞增殖，重塑免疫抑制TME，最终实现对原发性肿瘤86%的抑制率并有效抑制肺转移。该工作为设计能够诱导铁死亡、克服肿瘤免疫抑制的下一代光动力免疫治疗剂提供了新思路。
1 引言
免疫疗法通过调动机体免疫记忆来持续监视和清除残留及扩散的肿瘤细胞，已成为治疗血液恶性肿瘤和转移性肿瘤的有力策略。然而，其对实体瘤的临床疗效受到肿瘤异质性和复杂肿瘤微环境（TME）的严重限制。光动力疗法（PDT）因其独特的肿瘤杀伤机制和免疫调节能力，为增强免疫治疗效果提供了广阔前景。光敏剂（PSs）在光激活下产生活性氧（ROS），不仅能直接诱导肿瘤细胞死亡，还能触发免疫原性细胞死亡（ICD）。ICD促进损伤相关分子模式（DAMPs）的释放，刺激树突状细胞（DCs）成熟，并增强T细胞的活化、增殖和浸润，从而启动强大的抗肿瘤免疫反应。PDT与免疫疗法的结合已显示出重塑免疫抑制TME、放大瘤内免疫激活、减少肿瘤转移和复发的潜力。
然而，PDT诱导的ICD所引发的免疫反应面临三个关键限制，阻碍了PDT-免疫疗法的整体疗效。首先，传统PSs在生理环境中容易发生π–π堆积，导致ROS衰减，显著削弱PDT疗效并损害后续的免疫激活。其次，实体瘤内部的缺氧条件严重限制了氧气的可用性，从而损害了PSs产生ROS的能力，削弱了PDT的细胞毒性作用。第三，大多数PDT主要诱导细胞凋亡，这是一种免疫静默的细胞死亡模式，无法引发有效的免疫反应，从而限制了PDT与免疫疗法的协同益处。
幸运的是，具有聚集诱导发射（AIE）特性的I型PSs已成为解决这些挑战的有前途的方案。与传统PSs不同，AIE活性PSs在聚集状态下表现出特殊的荧光效率和I型ROS生成能力。其不依赖氧气的ROS生产能力确保了在缺氧TME中的卓越PDT性能，有效克服了缺氧引起的限制并维持免疫激活。这为联合光动力免疫疗法提供了强有力的技术支持。因此，合理设计和开发具有AIE特性的新型I型PSs至关重要。这类PSs应能够诱导免疫原性的、非凋亡性的细胞死亡模式，从而释放强大的抗肿瘤免疫反应，为下一代实体瘤光动力免疫治疗奠定坚实基础。
铁死亡是一种铁依赖性的调节性细胞死亡形式，以细胞内谷胱甘肽（GSH）耗竭、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）失活和脂质过氧化（LPO）积累为特征。这种独特的细胞死亡模式已被证明可引发急性炎症反应并激发强大的抗肿瘤免疫活性，使其成为癌症治疗中有前景的策略。然而，过度使用外源性金属可能引起细胞毒性、生物降解性差和复杂药代动力学等严重问题。此外，经典的小分子铁死亡诱导剂存在靶向特异性差、易产生耐药性以及对正常细胞造成附带损伤等固有局限性。这些挑战凸显了对具有更高安全性和精确性的铁死亡诱导替代策略的迫切需求。
阴离子-π+相互作用，一种包含缺电子π+核心和阴离子的非共价相互作用，可有效抑制分子内π–π堆积以增强AIE性能。相比之下，阴离子-π+型PSs可以简便合成，并且π+核心的强吸电子特性可能有利于电荷转移态的形成，从而使光谱红移至近红外区域。此外，阴离子-π+型AIE PSs在触发铁死亡方面具有巨大潜力，主要体现在两个方面：其一，缺电子的π+核心使其易于从生物分子或蛋白质中捕获电子，有效产生I型ROS。过量的ROS可以消耗细胞内GSH，导致GPX4活性间接抑制并促进LPO积累。其二，所携带的电荷使阴离子-π+型PSs能够选择性靶向亚细胞器，尤其是铁死亡过程的关键部位——线粒体。在线粒体内，升高的ROS水平可直接氧化多不饱和脂肪酸，从而放大LPO并驱动铁死亡性细胞死亡。
2 结果与讨论
2.1 TMPA和TMTPA的设计、表征与晶体分析
研究以易得的吖啶酮类似物为起点，通过铑催化的C=X（X=O或S）键与4,4′-(1,2-乙炔二基)双[N,N-二苯基苯胺]的氧化[4+2]环化反应，直接合成了杂原子掺杂的发光团TMPA和TMTPA。光物理性质表征显示，TMPA和TMTPA在PBS中具有广泛的吸收范围（460-750 nm），最大吸收峰分别位于540 nm和579 nm。发射光谱覆盖600-900 nm，最佳发射波长分别为730 nm和790 nm。密度泛函理论计算表明，两种发光团的最高占据分子轨道（HOMO）主要定位于三苯胺基团，而最低未占分子轨道（LUMO）主要定位于吖啶鎓π+核心。TMPA和TMTPA的HOMO与LUMO能隙计算值分别为2.46 eV和1.94 eV，表明硫原子的引入有效增强了吸电子能力，促进了分子内电荷转移，驱动了吸收光谱的红移。在DMSO/水混合溶剂体系中，TMPA和TMTPA表现出典型的AIE特性。单晶X射线衍射分析揭示了TMPA和TMTPA分子中存在显著的阴离子-π+相互作用（距离分别为3.52 ?和3.78 ?），以及丰富的分子内和分子间F…H、F…S相互作用，这些相互作用有效阻止了不利的π?π堆积，是其AIE特性的结构基础。
2.2 TMPA NPs和TMTPA NPs的制备及ROS生成
为增强水分散性和生物相容性，利用两亲性共聚物DSPE-mPEG2000通过纳米沉淀法将TMPA和TMTPA封装成纳米颗粒。动态光散射和透射电子显微镜结果显示，TMPA NPs和TMTPA NPs呈均匀球形，平均流体动力学直径分别为74 nm和94 nm，有利于通过增强渗透和滞留（EPR）效应从肿瘤血管外渗到肿瘤组织。光物理性质研究表明，TMTPA NPs相比TMPA NPs具有红移的吸收和发射光谱，以及显著的斯托克斯位移（135 nm），有利于生物成像应用。以2′,7′-二氯二氢荧光素为探针评估ROS生成能力，发现TMTPA NPs在635 nm激光照射60秒后，其DCFH荧光强度增强达339倍，显著高于TMPA NPs和参考光敏剂Ce6，表明TMTPA NPs具有最高的ROS生成能力。利用不同的ROS指示剂和电子自旋共振波谱证实，TMPA NPs和TMTPA NPs是典型的I型光敏剂，主要产生超氧阴离子和羟基自由基，而单线态氧的生成可忽略不计。时间依赖的密度泛函理论计算表明，硫原子的引入使TMTPA的单线态-三线态能隙减小，同时增加了S1态中(n, π*)跃迁的比例，促进了更高效的系间窜越过程，这从理论上解释了TMTPA NPs具有更高ROS效率的原因。
2.3 TMPA NPs和TMTPA NPs的细胞成像及体外抗肿瘤研究
流式细胞术监测显示，4T1细胞对TMPA NPs和TMTPA NPs的摄取随孵育时间增加而增强，在8小时达到平台期。共定位成像实验表明，TMPA NPs主要位于溶酶体，而TMTPA NPs表现出显著的线粒体靶向性。光漂白实验证明TMTPA NPs具有优异的抗漂白能力，成像潜力突出。使用DCFH-DA探针检测细胞内总ROS生成，发现TMTPA NPs处理并经激光照射的细胞绿色荧光信号显著增强。MTT法细胞毒性实验显示，TMTPA NPs在635 nm激光照射下表现出浓度依赖的光毒性，在4 μM浓度下细胞存活率仅为9.8%，而在黑暗条件下细胞存活率高达99%，表明其暗毒性可忽略不计。钙黄绿素AM/PI活死细胞染色结果直观地证实了TMTPA NPs的光动力治疗效果。JC-1染料检测线粒体膜电位的结果表明，TMTPA NPs加激光照射组细胞线粒体膜电位显著降低，红色与绿色荧光强度比值远低于PBS加激光组，表明线粒体功能受损。使用Fluo-4 AM探针检测到TMTPA NPs加激光照射组细胞内Ca2+离子水平显著升高，提示内质网应激的发生。
2.4 细胞死亡模式研究与铁死亡相关特征
为阐明TMTPA NPs诱导细胞死亡的主要方式，研究使用了多种细胞死亡抑制剂。结果表明，铁死亡抑制剂Ferrostatin-1能显著逆转TMTPA NPs加激光照射引起的细胞死亡，而凋亡、自噬、坏死性凋亡和焦亡的抑制剂对细胞存活率影响较小，证明铁死亡是TMTPA NPs光动力作用诱导的主要细胞死亡途径。透射电镜观察发现，TMTPA NPs加激光照射组细胞线粒体皱缩、嵴减少或消失，符合铁死亡的超微结构特征。生化检测显示，该处理组细胞内GSH水平降至PBS加激光组的23%，脂质过氧化探针C11-BODIPY荧光强度增强至5.8倍，脂质过氧化终产物丙二醛含量升至1.5倍。Western blotting分析进一步证实，TMTPA NPs加激光照射后，细胞内关键的脂质过氧化修复酶GPX4的蛋白表达水平显著下调。这些结果共同证实了TMTPA NPs能够在光照下有效诱导肿瘤细胞发生铁死亡。
2.5 体外细胞免疫应答
铁死亡可诱导免疫原性细胞死亡，触发CRT、HMGB1、HSP70等DAMPs的释放和ATP的胞外释放，激活免疫应答。免疫荧光染色显示，TMTPA NPs加激光照射组细胞质中CRT和HSP70荧光信号强烈，而HMGB1从细胞核中释放出来。检测表明，该处理组细胞外ATP水平是对照组的5.8倍，乳酸脱氢酶泄漏量是对照组的21.9倍，表明细胞膜损伤严重。将不同处理组的细胞上清液与骨髓来源的树突状细胞共培养后，流式细胞术分析显示，TMTPA NPs加激光照射组能显著促进DC的成熟，成熟率远高于其他对照组。这些结果表明，TMTPA NPs诱导的铁死亡能够释放大量DAMPs，为激活机体免疫和建立免疫记忆创造了有利条件。
2.6 TMTPA NPs的体内抗癌研究
体内分布实验显示，静脉注射TMTPA NPs后，肿瘤部位的荧光信号随时间逐渐增强，在12小时达到峰值，表明NPs通过EPR效应在肿瘤中有效富集，计算得到的肿瘤组织积累百分比约为1.1% ID/g。NPs主要分布在肿瘤组织的细胞外基质中，并主要通过肝胆途径代谢清除。在4T1荷瘤小鼠模型中，TMTPA NPs加激光照射治疗能显著抑制肿瘤生长，抑瘤率达86%，且对小鼠体重无明显影响，表现出良好的生物相容性。药代动力学显示TMTPA NPs的血浆半衰期为0.39小时，易于代谢。组织切片CD31和TUNEL染色显示，治疗组肿瘤血管生成被抑制，细胞凋亡增加。H&E染色可见治疗组肿瘤组织核固缩、核碎裂明显。GPX4免疫荧光染色证实治疗组肿瘤组织中GPX4表达下调，与体外铁死亡特征一致。
2.7 系统性抗肿瘤免疫的激活
TMTPA NPs光动力治疗可有效激活系统性抗肿瘤免疫。流式分析显示，治疗组小鼠脾脏中成熟DC的数量、CD4+和CD8+T细胞的比例及绝对数量均显著高于对照组。肿瘤组织免疫荧光染色也证实了CD8+和CD4+T细胞的浸润增加。同时，治疗组肿瘤内免疫抑制性的调节性T细胞比例下降，促炎的M1型肿瘤相关巨噬细胞比例增加，抗肿瘤的M1/M2比值升高。ELISA检测显示，治疗组小鼠血清中肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6和干扰素-γ等促炎细胞因子水平显著升高。此外，治疗组小鼠脾脏中中央记忆性T细胞比例显著增加，有利于建立长期的免疫记忆，预防肿瘤复发。对引流淋巴结的分析表明，免疫应答的启动源于肿瘤局部TMTPA NPs产生的ROS触发的铁死亡及随后释放的肿瘤抗原，而非NPs直接作用于淋巴组织。
2.8 肺转移评估
在建立4T1-Luc细胞肺转移模型的治疗实验中，TMTPA NPs加激光照射治疗能显著抑制肺转移结节的形成，肺部生物发光信号和H&E染色显示的肿瘤面积比例均远低于对照组，证明该疗法激发的免疫反应能有效识别和清除播散的肿瘤细胞，抑制肿瘤远处转移。
3 结论
该研究成功开发了一种具有近红外一区发射的阴离子-π+型I型AIE光敏剂TMTPA NPs。阴离子与π+核心间的多种分子相互作用有效防止了不利的π–π堆积，赋予了其AIE特性。硫化策略促进了分子内电荷转移，提高了系间窜越效率，使TMTPA NPs具有红移的光谱特征和高效的I型ROS生成能力。TMTPA NPs优异的线粒体靶向性和高效的细胞内ROS生成导致线粒体功能障碍、内质网应激以及致死性LPO水平升高，最终触发铁死亡。铁死亡过程伴随DAMPs的释放，可促进DCs成熟和T细胞活化，激活抗肿瘤免疫。凭借在肿瘤组织中的高效富集，TMTPA NPs实现了影像引导下的高效肿瘤治疗，并有效激发了免疫系统对转移瘤的持续监视和清除作用。该研究为设计能够诱导铁死亡、克服肿瘤缺氧和免疫抑制的下一代光动力免疫治疗剂提供了可行的策略。
