1 引言：面部形态发生机制与细胞骨架的作用
胚胎形态发生由多种细胞过程和行为共同协调，引导简单细胞层转化为复杂完整个体。细胞通过改变细胞骨架纤维极性重组亚细胞成分，其中丝状肌动蛋白（F-actin）网络影响细胞形状、极性、迁移和细胞外基质（ECM）粘附。细胞骨架与ECM粘附间的相互作用促进细胞力向组织水平传递，成为调节组织形态发生的基本机制，包括本综述关注的颅面发育。
1.1 颅面神经嵴细胞迁移在面部模式建立中的作用
颅神经嵴细胞贡献面部大部分骨骼、前颅骨、牙齿和结缔组织。细胞骨架影响颅面形态发生的最早时机发生在神经嵴细胞从背侧外胚层和神经管边界脱离和迁移期间。近期活体成像显示小鼠颅神经嵴细胞存在两种不同形态群体，各自在不同时间经历上皮-间质转化（EMT）。圆形神经嵴细胞亚群通过细胞骨架收缩从相邻细胞挤出，该过程由机械传感器Piezo控制。迁移开始时，圆形细胞经历后期EMT并加入已表达间质标记的极化神经嵴。迁移流前导的神经嵴细胞形成富含肌动蛋白的突起，与后缘的肌动蛋白介导收缩协同作用，实现定向细胞迁移。这种错时EMT和迁移群体可能允许更大规模的尾部神经细胞在头部形成，最终为创建面部结构提供充足细胞来源。
1.2 面部突起形态发生与融合
所有羊膜动物中，保守的面部突起排列围绕原始口腔。人类面部突起在妊娠第四周建立，哺乳动物有五处突起围绕原始口腔：额鼻突起、成对内测和外侧鼻突起、成对上颌和下颌突起。额鼻突或内侧鼻突产生前颌骨、鼻中隔和整个面部中线；上颌突产生腭骨、上颌骨和颧骨；外侧鼻突形成鼻道；下颌突产生整个下颌骨。
面部突起经历动态形态发生，包括显著的头尾延伸和额鼻突、上颌突及外侧鼻突的内外侧缩窄。类似的中面部缩窄模式也发生在人类发育中，将内侧鼻突聚集在一起。中面部缩窄失败可能导致眼距过宽或额鼻发育异常等异常。
形态发生的下一阶段在胚胎发育第六周将上面部突起融合形成连续唇部。参与唇融合的面部突起因物种而异：人类以上颌突和内侧鼻突为主要参与者，外侧鼻突贡献较小；而小鼠中三个面部突起的接触分布更均匀。通过差异增殖，突起增大并相互接触，在内侧鼻突、外侧鼻突和上颌突之间形成双层上皮缝。融合唇中的上皮缝随后通过细胞凋亡和径向细胞迁移等机制降解，一旦中间上皮降解，间质变得连续形成间质桥。融合后进行合并，填充任何残留沟槽并完成唇形成。
继唇融合之后，次级腭发育在妊娠第八周末开始。最初腭棚从上颌突内侧生长，在舌两侧垂直延伸。随着第九周下颌生长开始，舌向后重新定位，使腭棚重新定向至水平位置，向中线生长并融合。基于肌动蛋白的细胞收缩性在腭棚抬高过程中起重要作用。一旦腭棚水平重新定向，内侧边缘发生生长和接触。初始粘附较弱，由外周细胞顶面表达的蛋白聚糖介导，随后肌动蛋白细胞骨架通过重组和垂直于顶面重新定向参与粘附稳定，该排列被认为是腭粘附的前提。去除最外层外周细胞及随后基底细胞接触后，形成上皮缝，随后破裂允许间质汇合。除与对应部分融合外，腭棚还与原始腭和鼻中隔融合形成口腔顶。
高度协调的唇腭闭合中断导致各类口面裂。裂开可作为综合征部分发生，但绝大多数病例为孤立性，表现为伴或不伴腭裂的非综合征性唇裂（NSCL/P），是最常见的先天性面部畸形。NSCL/P具有多因素病因，涉及多种遗传变异和环境因素间复杂相互作用。通常为不对称性，左侧受累频率高于右侧（左侧42%，右侧25%，双侧31%）， observed asymmetry suggests that local factors play an important role in the etiology of NSCL/P.
2 RHO GTPases通过肌动蛋白细胞骨架调控细胞行为
细胞骨架由三种主要细丝组成：微丝（肌动蛋白细丝）、微管和中间丝。调控细胞骨架动态的主要通路是Rho GTPases家族，这些高度保守的小单体G蛋白是Ras超家族亚家族，约21kDa。在20个小Rho GTPase家族成员中，研究最广泛的是普遍表达的RHOA、RAC1和CDC42。小Rho GTPases调控细胞活动包括细胞骨架重塑、细胞分裂、形状、极性、粘附和运动。
Rho GTPases在时空限制方式下在活性和非活性形式间循环。活化发生在质膜，鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEFs）促进GDP释放，使GTP结合Rho蛋白并触发构象变化，而GTP酶活化蛋白（GAPs）增加GTP水解为GDP使GTPase蛋白活性降低。鸟嘌呤核苷酸解离抑制剂（GDIs）结合GDP结合的小Rho GTPase并将非活性形式维持在细胞质中。
活性RhoA主要通过Rho相关激酶（ROCK）介导其对肌动蛋白细丝的影响。ROCK通过直接磷酸化肌球蛋白轻链和抑制肌球蛋白轻链磷酸酶活性激活非肌肉肌球蛋白II（NMII），该级联触发应力纤维组装产生肌动球蛋白收缩性。此外，RhoA直接结合并激活形成蛋白mDia，促进肌动蛋白聚合成线性无分支细丝。RHOA还可刺激c-Jun N-末端激酶（JNK）调控基因转录，并优先磷酸化细胞骨架蛋白。通过Fos和ATF2也发生JNK介导的转录激活。
RAC1和CDC42通过Wiskott-Aldrich综合征蛋白（WASPs）施加对肌动蛋白细胞骨架的影响，激活肌动蛋白相关蛋白2/3（ARP2/3）。ARP2/3复合物是肌动蛋白聚合关键调节因子，促进从已有细丝侧面成核和分支肌动蛋白细丝，从而生成肌动蛋白网络。RAC1和CDC42控制细胞周边肌动蛋白聚合产生细胞骨架突起（板状伪足和丝状伪足）。此外，RAC1和CDC42还可通过激活JNK调节基因转录间接调控细胞骨架。
而且，三种小GTPases—RHOA、RAC1和CDC42—均调控粘着斑形成，这些是整合素富集位点，连接ECM至肌动蛋白细胞骨架。由细胞-ECM粘附和生长因子产生的信号反过来控制小Rho GTPases定位。小Rho GTPase活性对胚胎形态发生至关重要，在发育面部中普遍表达，但其在面部形态发生中的具体作用仍知之甚少。
3 具有颅面表型的人类RHO GTPases变异
3.1 RHOA在体细胞中的嵌合突变
人类中，RHOA变异的体细胞表达允许存活，并与颅面表型相关。神经外胚层综合征由RHOA嵌合体细胞变异引起，特别是在外胚层。涉及外胚层结构，包括外胚层发育不良、面部畸形、色素减退及肢体、眼和脑异常。七名无关患者面部表型包括对称或不对称面部特征、小额畸形、颧骨发育不全、眼裂下斜和宽鼻梁。还存在似乎影响釉质器官的牙齿异常。这些及其他变异在两个独立小组在具有神经外胚层面部表型患者中发现。有趣的是，一名错义RHOA变异患者出现不对称面部畸形和唇裂。基于功能测定，作者提出错义点突变导致功能降低并影响RHOA蛋白与下游效应子相互作用。
3.2 RAC1和CDC42错义变异导致脑和面部异常
涉及颅面异常的发育障碍与RAC1突变相关。近期研究在七个个体中发现RAC1七个de novo错义突变，位于RHO GTPase结构域保守区域附近。这些个体表现脑异常和颅面畸形，包括巨头或小头、突出额头和张口外观。功能分析显示某些变异表现显性阴性行为，而其他变异表现组成型RAC1激活特征。
CDC42突变也与颅面异常相关。研究在15名个体中识别九个与面部畸形相关的错义CDC42变异，如眼距过宽、面中部发育不全、宽口伴牙距过宽和腭裂。功能分析证明这些变异负面影响细胞增殖和迁移。
4 小RHO GTPases在面部发育中的体内外研究
Rho GTPase功能因细胞背景而异，需特别研究其在面部区域作用。若干体内外研究强调其在面部和腭发育中的重要性。
由于种系敲除致死性，小鼠模型中的功能丧失研究需要生成组织特异性敲除。使用P0-Cre或Wnt1-cre驱动因子条件性敲除Cdc42导致面中部裂伴腭裂。Cdc42神经嵴特异性敲除中裂形成机制似乎由于缺陷细胞骨架重塑和神经嵴细胞迁移减少而非凋亡增加。使用Wnt1-Cre条件性删除Rac1导致E13.0早期致死并因内侧鼻突大分离导致严重面中部裂，机制与神经嵴来源间质中增殖减少和凋亡增加相关。RhoA尚未在神经嵴细胞中条件性敲除。相关研究中，通过Wnt1-Cre表达下游效应子ROCK显性阴性形式以阻断信号转导，表型包括由于神经嵴细胞缺陷导致的面中部裂。
4.1 小GTPases体外研究界定其在唇腭融合中的作用
体外面部器官培养是研究形态发生过程的稳健通用模型，已广泛用于研究小GTPase信号在面部发育中的作用。小鼠腭器官培养研究显示RHOA活性可能为TGFβ3诱导EMT所必需。作者还发现TGFβ3激活RHOA信号同时减少CDC42和RAC3翻译。
我们使用鸡胚面部器官培养证明ROCK阻断额鼻突缩窄。通过活成像结合细胞追踪，显示使用Y27632药理学抑制RHOA信号破坏间质细胞协调对称运动，最终阻断额鼻突缩窄。微管动态作用研究显示微管去稳定药物诺考达唑通过触发RHOA特异性GEF GEF-H1从细胞-细胞连接重新定位至细胞质激活RHOA/ROCK通路，该激活诱导腭棚中部区域肥大、多层MEE。
除RHOA外，RAC1在次级腭融合中也发挥独特作用。研究显示RAC1在体内棚抬高期间中腭区表现差异时空表达。腭器官培养中RAC1过表达因改变细胞密度和纤连蛋白 disorganization 破坏融合。后续研究揭示视黄酸（RA）足以下调Rac1表达，破坏纤连蛋白纤维组织并损害细胞迁移，从而促进RA诱导腭裂发病机制。
小鼠腭活成像研究证明成功融合需要肌动球蛋白收缩性，该过程依赖于RHOA信号下游的ROCK活性。Y27632处理通过损害NMII介导收缩性阻断腭棚融合。后续研究使用遗传改变小鼠活成像腭融合，显示外胚层肌动球蛋白收缩性丧失导致腭中线上皮缝崩解失败。
RHOA信号也显示在下游干扰素调节因子6（IRF6）间接作用，该基因与综合征和非综合征口面裂相关。IRF6突变导致Van der Woude综合征（VWS），最常见综合征性口面裂形式。研究检查IRF6-/-小鼠胚胎角质形成细胞行为，显示IRF6缺陷角质形成细胞在划痕试验中表现间隙闭合能力降低，活性RHOA水平增加，表明IRF6正常功能为降低RHO活性。此外，ROCK抑制能够挽救IRF6缺陷角质形成细胞划痕试验中延迟伤口闭合。IRF6与RHOA间连接似乎通过GAP蛋白ARHGAP29。
5 与人类口面裂相关的GAP和GEFs
尽管尚未识别人类口面裂与RHOA、RAC1或CDC42变异直接关联，但已在编码调节蛋白包括GAPs和GEFs的基因中报道多种变异。
5.1 ARHGAP29与NSCL/P风险关联
ARHGAP29位于人类染色体1p22。ARHGAP29蛋白含四个功能结构域：促进膜磷脂结合的F-BAR结构域、锌指结构域、介导与小Rho GTPases相互作用的高度保守Rho-GAP结构域，及与蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPL1）相互作用的C-末端小区域。E10.5小鼠胚胎面部区域全mount原位显示Arhgap29转录物在整个面部突起中检测到，包括对唇腭发育必需的内侧和外侧鼻突。抗体染色显示面部上皮中ARHGAP29表达相对较高，也有一些间质信号。
首次GWAS提示ARHGAP29与NSCL/P间潜在联系识别1p22位点SNP。后续研究识别ARHGAP29 Lys326*变异作为1p22位点内与NSCL/P显著相关。后续研究在多种族裔中识别约29个可能致病性ARHGAP29变异。推定的致病性变异包括错义、移码和无义变异，截短变异预测由于无义介导衰变或破坏蛋白功能导致功能丧失。ARHGAP29蛋白丧失将损害GTPase激活功能，导致小Rho GTPases持续激活。ARHGAP29耗竭后伴随下游效应子上调，该异常RHOA活性增加已在多项研究中证明。ARHGAP29功能丧失变异被描述为NSCL/P主要遗传风险因素。
5.2 小鼠Arhgap29功能基因组学研究
近期研究小鼠模型中Arhgap29要求使用CRISPR/Cas9介导基因编辑或Arhgap29 floxed等位基因。基因编辑方法导致小体型同窝仔不能存活至出生后7天，E14.5时Arhgap29-/-胚胎表现谱异常 resembling EEC综合征。未发表研究中，使用EctCre+条件性删除小鼠外胚层Arhgap29导致部分穿透性腭裂表型。
人类ARHGAP29变异已在小鼠和斑马鱼中研究。携带ARHGAP29 Lys326*变异细菌人工染色体插入小鼠基因组导致纯合条件早期致死性。杂合胚胎出生并存活至成年，E14.5观察到短暂上皮粘附，但最终解决，腭完全闭合所有ARHGAP29K326X/+胚胎正常。
斑马鱼研究调查错义ARHGAP29变异功能影响，该变异将Ser552变为Pro。该错义变异通过外显子组测序在三代多重家族中识别，该家族具有单纯腭裂特征。作者在单细胞阶段注射编码wtARHGAP29或ARHGAP29变体RNA，wtARHGAP29干扰外包，但Ser552Pro变体允许正常发育。
5.3 与NSCL/P相关的GEFs
GEFs通过催化GDP交换为GTP激活RHO GTPases，从而将其从非活性转化为活性状态。少数研究识别RHO GEFs可能参与口面裂。首次识别RHO GEF可能参与口面裂研究通过病例-父母三人家系SNP数据进行全基因组筛选，识别ARHGEF10基因变异与母亲饮酒间潜在相互作用。后续CNVs全基因组分析识别ARHGEF38作为裂相关基因候选。非洲爪蟾中同源arhgef38基因表达显示在头部区域包括预定鳃弓表达。使用 morpholino 或CRISPR-Cas9介导删除非洲爪蟾Arhgef38导致颅面畸形和软骨表型。
NSCL/P患者原代细胞全外显子测序揭示ARHGEF18核苷酸变化。功能分析进一步证明这些患者来源细胞表现细胞骨架失调，包括极性丧失和迁移能力降低。近期GWAS进一步识别ARHGEF18和ARHGEF19中SNPs与NSCL/P风险间新关联。
6 未来展望：研究唇腭融合期间RHO GTPases信号上游调节因子和下游介质
基于大量人类和小鼠研究证据表明小GTPases参与面部形态发生，研究其与面部发育重要其他信号通路连接至关重要。若干面部形态发生所需通路已发现通过小Rho GTPases调节肌动蛋白细胞骨架，包括骨形态发生蛋白通路、WNT/平面细胞极性通路、成纤维细胞生长因子、Sonic hedgehog信号、TGFβ信号和RA。这些信号如何影响Rho GTPase， whether directly in the cytoplasm or by altering transcription of Rho GTPases remains to be seen.
Rho GTPase信号下游效应子 beyond ROCK, WASP, JNK also not well understood. More unbiased bulk RNA sequencing to profile early gene expression changes in the facial prominences in the knockout animals or those expressing variants of Arhgap29 would be necessary to discover novel effectors. Further functional studies are warranted to assess the role of other Rho GTPases, GAPs, and GEFs using human-relevant genetic variants.
重要问题 remains how such ubiquitously expressed GTPases can play a role in a specific malformation like non-syndromic orofacial clefting. In addition, there is a notable lack of studies investigating the consequences of increased small GTPases activities on facial morphogenesis. We propose a different hypothesis that rare variants may alter the careful spatial and temporal activation or inactivation of small Rho GTPases during facial morphogenesis, resulting in transient changes in cell behavior, such as altered migration, shape, or adhesion. When coupled with environmental factors, these transient disruptions may impair normal morphogenesis in the face and contribute to cleft formation.
