《Cell Death & Disease》：Targeting PLK1 potentiates the antitumor efficacy of EGFR-TKIs through inhibiting the JAK1/STAT3 pathway
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本刊推荐：本研究深入探讨了PLK1在EGFR突变非小细胞肺癌（NSCLC）中的关键作用，首次揭示PLK1通过蛋白互作和JAK1介导的磷酸化调控STAT3活性，同时STAT3反向调控PLK1转录，形成正反馈循环。该循环被FGFR1上调强化，直接导致EGFR-TKI耐药。联合抑制EGFR和FGFR1/STAT3/PLK1信号轴可产生协同抗肿瘤效应，为克服EGFR-TKI耐药提供了创新性治疗策略。
PLK1抑制剂在EGFR突变NSCLC中展现广谱抗增殖活性及临床潜力
针对EGFR-TKIs耐药这一临床挑战，研究团队通过对PC9（EGFR外显子19 ELREA缺失）和NCI-H1975（EGFR L858R/T790M）细胞系进行化合物库筛选，发现PLK1抑制剂（如volasertib和BI-2536）在EGFR突变NSCLC细胞系中表现出显著抗增殖活性。进一步实验表明，PLK1抑制剂对携带不同EGFR突变（包括T790M和C797S二次突变）的Ba/F3转化细胞系同样有效，IC50值范围为5-10 nM。RNA测序分析显示，volasertib处理可显著下调4232个基因，其中KEGG富集分析提示这些基因主要富集于细胞凋亡、NF-κB信号、TGF-β信号和ErbB信号通路。临床数据库分析证实，PLK1 mRNA在EGFR突变NSCLC患者肿瘤组织中显著高表达，且与ErbB信号通路激活呈正相关。值得注意的是，PLK1高表达组患者中晚期（III期和IV期）病例数量更多，且预后较差。
PLK1抑制剂与EGFR-TKIs联用展现协同抗肿瘤效应
为提升疗效并降低毒性，研究团队评估了volasertib与osimertinib联用的效果。Calcusyn软件计算的联合指数（CI）值表明，该组合在多种EGFR突变细胞系（包括携带二次突变的细胞）中均表现出协同抗增殖作用。克隆形成实验进一步证实，PLK1抑制剂与EGFR-TKIs联用可协同抑制细胞增殖。流式细胞术检测显示，联合处理显著增加了NCI-H1975和PC9细胞的凋亡率，Western blot分析也观察到cleaved caspase-3和PARP水平升高。在PC9异种移植瘤模型中，联合治疗组所有小鼠均在39天时达到肿瘤消退，且停药后至60天未出现复发，而单药治疗组则观察到肿瘤再生。所有治疗方案均未引起小鼠体重显著变化，表明联合用药耐受性良好。
PLK1抑制剂逆转EGFR/MEK/ERK抑制诱导的STAT3激活
为探究联合用药的协同机制，RNA测序分析发现，osimertinib处理可上调2077个基因，其中KEGG富集分析显示这些基因显著富集于EGFR-TKI耐药通路。热图分析表明，IL6R、JAK1和STAT3在osimertinib处理的PC9细胞中协调上调。Western blot验证了EGFR-TKIs（osimertinib和afatinib）以及MEK/ERK抑制剂可抑制EGFR、AKT和ERK磷酸化，但同时诱导STAT3激活。值得注意的是，PLK1抑制剂volasertib和BI-2536可有效抑制STAT3磷酸化，并逆转osimertinib诱导的STAT3激活。基因敲低实验证实，PLK1 knockdown可有效逆转osimertinib和trametinib诱导的STAT3激活。STAT3抑制剂STAT3-IN-3和JAK1/2抑制剂momelotinib均可增强EGFR突变NSCLC细胞对osimertinib的敏感性。反之，PLK1和STAT3的共过表达则显著降低细胞对osimertinib的敏感性。这些结果表明，PLK1抑制剂通过功能性地逆转EGFR-TKI诱导的STAT3激活来提升疗效。
PLK1参与JAK1介导的STAT3磷酸化
TCGA数据库分析显示，PLK1和STAT3共表达可显著恶化EGFR突变NSCLC患者的生存预后。免疫共沉淀联合LC-MS/MS蛋白质组学分析在NCI-H1975细胞中鉴定出1798个PLK1互作蛋白，其中60个与ErbB信号通路（包括PI3K/AKT、MAPK和JAK/STAT信号通路）重叠。GO/BP富集分析表明，这些重叠蛋白主要参与蛋白质磷酸化、信号转导和转录等生物学过程。LC-MS/MS鉴定出6个STAT3肽段、5个STAT1肽段和2个JAK1肽段。结构模型预测显示，PLK1的PBD结构域（PB2）分别与JAK1的激酶结构域（JH1）和STAT3的SH2结构域相互作用。免疫共沉淀实验证实了PLK1与JAK1/STAT3之间存在相互作用。遗传学操作表明，PLK1 knockdown仅轻微影响STAT3基础表达，但显著抑制其磷酸化；而PLK1过表达则增强STAT3磷酸化。核质分离实验和免疫荧光分析证实，PLK1抑制剂可显著抑制STAT3的核转位。有趣的是，STAT3 knockdown也显著降低PLK1的转录和蛋白表达，表明STAT3和PLK1之间存在相互调控。
异常的FGFR1/STAT3/PLK1轴介导EGFR突变NSCLC对EGFR-TKIs的耐药
通过逐步增加osimertinib浓度，研究团队成功构建了奥希替尼耐药细胞系（PC9/OR）。RNA测序分析显示，PC9/OR细胞中1535个基因上调，GO和KEGG富集分析表明这些基因主要富集于上皮间质转化（EMT）和FGFR信号通路。单克隆筛选获得PC9/OR3细胞系，该细胞系对一、二、三代EGFR-TKIs均产生耐药（耐药因子分别为399、5377和388）。Western blot证实PC9/OR3细胞中E-钙黏蛋白表达下调，N-钙黏蛋白和波形蛋白表达上调，表明EMT是耐药的重要特征。RT-qPCR和Western blot分析显示，PC9/OR3细胞中FGFR1表达显著上调。FGFR1 knockdown或FGFR抑制剂zoligratinib处理可显著抑制PC9/OR3细胞增殖，而FGFR1过表达则降低PC9细胞对osimertinib的敏感性。机制研究表明，FGFR1上调可促进STAT3磷酸化和PLK1表达，而FGFR1抑制则逆转这一效应。在PC9/OR3细胞中，PLK1和STAT3之间的相互作用更强，且存在PLK1-STAT3正反馈循环。敲低PLK1或STAT3均可显著增强PC9/OR3细胞对osimertinib的敏感性。
靶向PLK1/STAT3轴增强奥希替尼在EGFR-TKI耐药模型中的疗效
在PC9/OR3细胞中，FGFR抑制剂（zoligratinib、ponatinib、nintedanib）、JAK/STAT3抑制剂（momelotinib、STAT3-IN-3）和PLK1抑制剂（volasertib、BI-2536）与osimertinib联用均表现出协同抗增殖效应（CI<1）。在三维培养模型中，联合治疗可显著抑制PC9/OR3细胞球的生长和活力。划痕实验和Transwell实验表明，volasertib与osimertinib联用可显著抑制PC9/OR3细胞的迁移能力。机制上，联合治疗可增强对STAT3和AKT磷酸化的抑制，并下调c-Myc和Mcl-1表达。在PC9/OR3异种移植瘤模型中，联合治疗表现出更强的肿瘤生长抑制和肿瘤重量减轻，且未引起显著体重变化。Western blot分析显示，联合治疗组肿瘤组织中STAT3和AKT磷酸化水平显著降低，c-Myc表达下调。
讨论
本研究通过高通量药物筛选发现PLK1是EGFR突变NSCLC的潜在治疗靶点。PLK1抑制剂与EGFR-TKIs联用可协同抑制肿瘤生长，并克服获得性耐药。机制上，PLK1通过蛋白互作和JAK1介导的磷酸化调控STAT3活性，而STAT3反向调控PLK1转录，形成正反馈循环。该循环被FGFR1上调强化，直接导致EGFR-TKI耐药。靶向PLK1/STAT3轴可逆转EGFR/MEK/ERK抑制诱导的STAT3激活，从而增强疗效。本研究为EGFR突变NSCLC的治疗提供了新的联合策略，特别是针对EGFR-TKI耐药的患者。未来研究可探索FGFR抑制剂、奥希替尼和PLK1抑制剂的三药联合方案，以更有效地根除残留肿瘤细胞并促进肿瘤消退。
