《Chemistry & Biodiversity》：Cytotoxic and Antileishmanial Potential of Pilocarpus microphyllus Essential Oil: In Vitro and In Silico Study
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本文系统研究了从小叶毛果芸香（Pilocarpus microphyllus）鲜叶和干叶中提取的精油（EOJ），通过GC-MS分析鉴定出γ-杜松烯（γ-cadinene，23.6%）和反式-石竹烯（trans-caryophyllene，22.9%）为主要成分。研究发现EOJ对新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）具有抗真菌活性（MIC: 149–2395 μg/mL），并对亚马逊利什曼原虫（Leishmania amazonensis）前鞭毛体表现出显著抑制作用（IC50: 22.8–25.2 μg/mL）。此外，EOJ对HCT-116（结肠癌）和PC-3（前列腺癌）细胞系具有细胞毒性（IC50: 27.8–29.2 μg/mL）。计算机模拟显示其主要成分与治疗靶点（如Nectin-4、lanosterol 14α-demethylase）有强结合亲和力，ADMET预测表明其具有良好口服吸收性和低遗传毒性。本研究为EOJ作为抗感染和抗肿瘤先导化合物开发提供了科学依据。
1 引言
小叶毛果芸香（Pilocarpus microphyllus Stapf）作为传统药用植物，其生物活性研究长期以来集中于毛果芸香碱等生物碱。然而，该植物精油（EOJ）的化学组成与药理潜力仍待深入探索。本研究通过气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术分析了EOJ的化学成分，并系统评估了其抗真菌、抗利什曼原虫和细胞毒性活性，结合计算机模拟（in silico）方法揭示了其潜在分子作用机制。
2 结果与讨论
2.1 精油化学成分分析（气相色谱-质谱联用）
通过水蒸气蒸馏法从鲜叶（FL）和干叶（DL）中提取EOJ，得率分别为0.16%和0.27%。GC-MS分析共鉴定出24种成分，主要包括单萜、倍半萜和脂肪酮类化合物。其中，γ-杜松烯（最高23.62%）、反式-石竹烯（最高22.95%）和2-十三烷酮（最高20.92%）为主要成分。干燥过程导致单萜和部分倍半萜相对含量降低，这解释了FL-EOJ与DL-EOJ的成分差异。
2.2 抗菌活性
EOJ在最高测试浓度（>4790 μg/mL）下对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 25923）和大肠杆菌（Escherichia coli ATCC 25922）均未表现出显著抗菌活性，这与毛果芸香属（Pilocarpus spp.）精油抗菌活性有限的报道一致。
2.3 抗真菌活性
EOJ对新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）菌株表现出抗真菌活性，最小抑菌浓度（MIC）值为2395 μg·mL?1。其中，对C. neoformans ATCC 32269的活性最强（FL-EOJ的MIC = 149 μg·mL?1），属于中等活性。DL-EOJ对克鲁斯念珠菌（Candida krusei ATCC 6258）和近平滑念珠菌（Candida parapsilosis ATCC 22019）无抑制活性，而FL-EOJ对这两种菌的MIC均为4790 μg·mL?1。精油可能通过破坏真菌细胞壁和线粒体膜，诱导细胞凋亡发挥抗真菌作用。
2.4 针对真菌靶点的分子对接研究
分子对接结果显示，反式-石竹烯与羊毛甾醇14α-去甲基酶（lanosterol 14α-demethylase，PDB ID: 6UEZ）的结合自由能（ΔGbind）为-8 kcal·mol-1。γ-杜松烯与该酶的结合自由能为-7.4 kcal·mol-1。这些相互作用主要为疏水作用，表明它们可能通过干扰麦角固醇生物合成，破坏真菌细胞膜完整性。
2.5 体外抗利什曼原虫活性
FL-EOJ和DL-EOJ在800 μg·mL?1浓度下可完全抑制亚马逊利什曼原虫（Leishmania amazonensis）前鞭毛体的生长。EOJ的抗利什曼原虫活性优于许多其他 Rutaceae 和 Lamiaceae 科植物的精油，这可能归因于其富含的倍半萜类成分具有强亲脂性和膜渗透能力。
2.6 针对利什曼原虫靶点的分子对接研究
分子对接模拟针对利什曼原虫表面重要的毒力因子——利什曼溶蛋白（leishmanolysin，gp63，PDB ID: 1LML）进行。反式-石竹烯与1LML的结合自由能为-5.7 kcal·mol-1，主要与VAL A:113、VAL A:165、LYS A:158等残基发生疏水相互作用。γ-杜松烯与1LML的结合自由能为-5.6 kcal·mol-1。这些相互作用可能干扰利什曼原虫的补体抵抗和巨噬细胞入侵过程。
2.7 体外细胞毒性活性
EOJ对HCT-116（结肠癌）和PC-3（前列腺癌）细胞系表现出中等细胞毒性，IC50值在27.8至29.2 μg/mL之间，低于通常判定具有相关细胞毒性潜力的阈值（30 μg/mL）。这种活性可能源于精油中各成分的协同效应。
2.8 针对肿瘤靶点的分子对接研究
分子对接分析揭示了EOJ主要成分与肿瘤进展关键蛋白的相互作用。γ-杜松烯与Nectin-4蛋白（PDB ID: 4MAN）的结合自由能为-7.3 kcal·mol-1。反式-石竹烯与人类雄激素受体（Androgen Receptor, AR, PDB ID: 1E3G）的结合自由能为-7.3 kcal·mol-1。这些相互作用涉及MET、LEU、PHE等关键疏水残基，表明它们可能作为这些分子靶点的天然抑制剂。十三烷酮的结合自由能较低，提示其在EOJ的细胞毒性活性中起次要作用。
2.9 预测的ADMETox特性（pkCSM）
计算机模拟药代动力学和毒性预测表明，三种主要化合物均表现出高肠道吸收率（>88%）、广泛的组织分布（VDss > 0.5 log L/kg）和良好的中枢神经系统（CNS）渗透性（γ-杜松烯和反式-石竹烯）。尽管水溶性较低，但可通过合适的制剂策略解决。在代谢方面，γ-杜松烯被鉴定为CYP3A4底物和CYP1A2抑制剂，而反式-石竹烯抑制CYP2C19。所有化合物在Ames试验中均无遗传毒性，也不是显著的hERG通道抑制剂。然而，预测显示γ-杜松烯和十三烷酮具有潜在的肝毒性，提示长期全身给药的安全性需关注。
3 结论
本研究结果表明，小叶毛果芸香精油（EOJ）具有良好的生物活性潜力。其主要成分γ-杜松烯、反式-石竹烯和十三烷酮贡献了其抗真菌、抗利什曼原虫和细胞毒性作用。计算机模拟研究为其多靶点作用机制提供了支持。EOJ作为一种具有多种药理活性的天然产物来源，在抗感染和抗肿瘤药物开发领域具有重要的研究价值。
4 实验部分
4.1 植物材料
研究使用的毛果芸香鲜叶和干叶采集自巴西帕纳伊巴市。植物样本鉴定后保存于标本馆。
4.2 提取与分析化学
采用水蒸气蒸馏法提取精油，并通过GC-MS分析其化学成分。化合物通过保留指数和质谱数据库比对进行鉴定。
4.3 抗菌药敏试验
采用肉汤微量稀释法评估EOJ对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌活性。
4.4 抗真菌药敏试验
采用肉汤微量稀释法（CLSI M27-A3方案）评估EOJ对多种念珠菌和隐球菌的抗真菌活性。
4.5 对亚马逊利什曼原虫前鞭毛体活性的研究
通过刃天青（resazurin）法检测EOJ对利什曼原虫前鞭毛体生长的抑制活性。
4.6 体外细胞毒性效应
采用MTT法评估EOJ对HCT-116和PC-3癌细胞的细胞毒性。
4.7 计算机模拟研究ADME/Tox
使用pkCSM在线服务器预测主要成分的ADMET特性。
4.8 计算机模拟方案
使用Gaussian软件对配体分子进行结构优化。
4.9-4.11 分子对接靶点选择
针对真菌、利什曼原虫和肿瘤相关的关键蛋白靶点进行分子对接研究。
4.12 分子对接
使用AutoDock Vina进行分子对接模拟，分析配体与靶蛋白的相互作用。
4.13 统计分析
实验数据以均值±标准差表示，采用GraphPad Prism软件进行统计分析。
