《LWT》：Droplet microfluidics-based isolation, adaptation, and screening of riboflavin-producing lactic acid bacteria for fermenting plant-based dairy alternatives
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本研究针对植物基乳制品替代品（PBDA）核黄素（维生素B2）强化需求，开发了一种结合透明豆基培养基（TSM）与微滴微流控的高通量筛选策略。研究人员通过玫瑰霉素适应性进化与荧光激活微滴分选（FADS）技术，从蜂肠道微生物群中直接分离出能在豆基基质中高效合成核黄素的乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）NFICC2835。该菌株在商业豆奶中核黄素产量达1.23 mg/L，基因组分析揭示其核黄素操纵子（rib operon）和purH基因周边存在13个错义突变，FMN核开关区域的关键突变可能解除核黄素合成的反馈抑制。该研究为功能性植物基发酵食品开发提供了创新技术路径和优良菌种资源。
随着健康、动物福利和环境可持续性意识的提升，全球饮食结构正加速向植物基转型，植物基乳制品替代品（PBDA）市场呈现爆发式增长。然而，相较于传统乳制品，植物基产品往往存在维生素和矿物质含量不足的天然短板。核黄素（维生素B2）作为人体必需营养素，是黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和黄素单核苷酸（FMN）等辅酶的核心组分，参与体内多种氧化还原反应。长期摄入不足会导致口角炎、舌炎等典型缺乏症，甚至引发偏头痛、贫血等健康问题。目前工业界多采用人工强化方式补充核黄素，但消费者对清洁标签（clean-label）产品的偏好，催生了通过微生物发酵实现天然强化的技术需求。
乳酸菌（LAB）作为传统发酵剂的核心菌种，在改善产品营养与风味方面具有独特优势。但现有工业菌株多针对乳制品基质优化，难以适应植物基复杂环境。蜂肠道作为植物相关微生物的天然储库，其蕴含的高多样性乳酸菌资源为植物基发酵剂开发提供了新思路。传统微生物筛选方法存在通量低、优势菌株掩盖稀有菌、耗时长等瓶颈，而微滴微流控技术通过将细胞隔离在皮升级液滴中，不仅能实现单细胞水平的高通量培养，还可消除菌株间竞争，为稀有功能菌株挖掘提供技术突破点。
针对上述问题，丹麦技术大学研究团队在《LWT》发表论文，创新性地将微滴微流控技术应用于植物基发酵乳酸菌的定向选育。研究团队首先开发出透光性良好的透明豆基培养基（TSM），通过调节pH值与过滤去除不溶性物质，并补充磷酸二氢钾（KH2PO4）维持缓冲体系，成功解决了植物基质易堵塞微流控芯片的难题。以蜂肠道微生物为菌种资源库，研究人员设计出“适应性进化-分选”循环策略：将菌群封装于含玫瑰霉素（核黄素结构类似物）的TSM微滴中进行胁迫适应性培养，随后转换至无压力培养基中，通过荧光激活微滴分选（FADS）捕获核黄素高产液滴（图1）。为排除非乳酸菌干扰，实验引入MLS琼脂（乳酸菌选择性培养基）进行菌群纯化，经过五轮循环筛选，最终获得一株核黄素产量提升18倍的乳酸乳球菌NFICC2835。
关键技术方法包括：基于透明豆基培养基（TSM）的微滴生成技术、玫瑰霉素胁迫下的微生物适应性进化策略、荧光激活微滴分选（FADS）系统、全基因组测序与单核苷酸多态性（SNV）分析、API 20E糖代谢表型鉴定，以及高效液相色谱（HPLC）核黄素定量检测。研究样本来源于丹麦日德兰半岛采集的野生熊蜂（Bombus terrestris）肠道微生物。
适应性进化与分选效率评估
通过五轮“胁迫-分选”循环，菌群核黄素产量呈现阶梯式增长（图2）。首轮筛选即实现2.19倍提升，第三轮达到11.28倍，最终轮次产量较初始菌群提高18.06倍。统计检验证实各轮次间增量均具显著性（P<0.05），证明该策略可有效富集高产突变株。
菌株水平核黄素生产能力验证
从最终轮次分离的16株乳酸乳球菌均表现出稳定核黄素合成能力（图3）。HPLC检测显示产量区间为0.63-1.02 mg/L，其中NFICC2835（原编号R5-15）产量最高（1.02 mg/L），NFICC2834（R5-13）次之（0.95 mg/L），显著优于原始菌群对照（检测限以下）。
核黄素过量合成的基因组学基础
全基因组比对发现NFICC2835在核黄素操纵子（ribG-ribB-ribA-ribH）和purH（嘌呤合成关键酶）基因周边存在13个错义突变（表2）。非编码区突变尤为关键：FMN核开关（ribG上游）的G>C突变破坏RNA二级结构GC配对，可能解除核黄素合成的反馈抑制；purH启动子区两个突变则可能降低其转录活性，通过增加鸟嘌呤核苷三磷酸（GTP）前体供应促进核黄素合成。
广谱碳源利用特性表征
API 20E测试显示NFICC2835可代谢21种碳源（图4），包括阿拉伯糖、木糖等植物常见单糖，纤维二糖、麦芽糖等双糖，以及淀粉等多糖。尤其对淀粉的高效利用能力，凸显其适应谷物基发酵应用的潜力。
植物基基质发酵稳定性验证
在三种商业豆奶中，NFICC2835均实现稳定核黄素合成（1.07-1.23 mg/L），且不受本底核黄素强化影响（图5）。在蛋白质含量>1%的基质（如Almond Spir、燕麦大师）中产量显著，而低蛋白基质（普通米奶、燕麦奶）发酵效率较低，提示蛋白质含量为乳酸菌植物基发酵的关键限制因子。
该研究通过微滴微流控技术实现了微生物筛选范式的创新，将传统“先分离后筛选”流程转变为“群落水平直接功能筛选”模式（图6）。NFICC2835菌株的FMN核开关突变使其在核黄素富集环境中仍保持持续合成能力，突破天然调控限制。研究不仅为植物基食品天然营养强化提供优良工程菌种，更建立了一套适用于复杂基质的功能微生物挖掘技术平台。这种将微生物资源挖掘、适应性进化与高通量筛选相结合的策略，为加速功能性食品开发提供新范式，尤其对解决植物基食品营养素生物强化的技术瓶颈具有重要实践意义。
