《npj Parkinson's Disease》：UQCRC1 deficiency impairs mitophagy via PINK1-dependent mechanisms in Parkinson’s disease
编辑推荐：
本研究针对帕金森病中线粒体功能障碍与线粒体自噬失衡的关键科学问题，通过整合19项人脑黑质转录组数据发现UQCRC1表达显著降低。研究人员利用细胞和果蝇模型证实UQCRC1缺陷通过下调PINK1抑制线粒体自噬，并首次证明PINK1激动剂可逆转相关病理表型，为帕金森病的精准治疗提供了新靶点。
当我们谈论帕金森病时，我们面对的是全球第二常见的神经退行性疾病，其特征包括进行性的运动迟缓、肌肉僵硬和震颤，其根本病理变化是中脑黑质多巴胺能神经元的逐渐丧失。尽管遗传学研究不断深入，但约78%的帕金森病病例仍被定义为散发性，缺乏明确的遗传病因。目前治疗方法主要针对症状缓解，而非阻止疾病进展。因此，揭示帕金森病的分子机制对于开发疾病修饰疗法至关重要。
帕金森病的分子病理机制复杂且异质性高。值得注意的是，导致帕金森病的一个关键因素是线粒体呼吸链功能障碍引起的氧化磷酸化应激。这可以通过神经毒素MPTP的例子来证明，其代谢物会破坏线粒体呼吸链，导致神经元死亡和帕金森综合征。遗传学研究进一步强化了氧化磷酸化功能障碍在帕金森病发病机制中的作用。数个帕金森病相关基因的突变已被证明会影响线粒体呼吸链复合物。例如，寡聚化的突变α-突触核蛋白破坏复合体I；CHCHD2的缺失 destabilizes 复合体IV；DJ-1的突变损害其增强复合体V ATP合酶功能的能力。这些毒素和遗传模型的研究共同支持氧化磷酸化应激是帕金森病发病机制的核心。
除了氧化磷酸化应激，线粒体自噬受损也与帕金森病发病机制密切相关。线粒体自噬是一种关键的线粒体质量控制机制，通过自噬 sequestration 清除功能失调或多余的线粒体。PINK1和Parkin是负责启动线粒体自噬的两个主效酶。在线粒体应激时，PINK1激酶在线粒体外膜上稳定并通过自身磷酸化激活，在那里它磷酸化泛素和E3泛素连接酶Parkin。磷酸化的Parkin进而泛素化线粒体外膜蛋白，导致泛素结合自噬受体的募集，并最终通过自噬清除受损线粒体。一些帕金森病病因已被提出会影响线粒体自噬，包括过量的α-突触核蛋白和LRRK2突变。最近，一项利用帕金森病患者死后中脑的蛋白质组学研究发现，呼吸链复合物的缺陷与线粒体质量控制蛋白表达减少相关。此外，有报道称在慢性氧化磷酸化缺陷的细胞中，溶酶体功能受损。相反，在氧化磷酸化刺激下，神经元中的线粒体自噬增强。这些观察结果表明氧化磷酸化活性在线粒体自噬中扮演调节角色，但其详细机制尚不清楚。
UQCRC1编码线粒体呼吸链复合体III的一个核心亚基，是近期从一个多中心东亚人群研究中被鉴定出的家族性帕金森病基因。与帕金森病相关的错义变异p.Y314S导致耗氧量和ATP生成率降低。携带UQCRC1 p.Y314S突变的小鼠表现出多巴胺能神经元丢失和运动缺陷，在uqcrc1敲低的果蝇中也观察到类似表型。迄今为止，UQCRC1突变体是唯一已知的编码线粒体呼吸链组分的帕金森病相关遗传变异。阐明UQCRC1缺陷是否影响线粒体自噬，可能为电子传递链复合体调节线粒体自噬的具体机制提供见解。
在这项研究中，Jeng-Lin Li等人将他们对UQCRC1作用的研究从家族性帕金森病扩展到散发性帕金森病。他们首先利用开源数据集进行了荟萃分析，揭示低水平的UQCRC1与散发性帕金森病相关。使用细胞和果蝇模型，他们证明了在UQCRC1突变或敲低时线粒体自噬受损。此外，他们观察到UQCRC1相关的线粒体自噬损伤伴随着PINK1的减少。值得注意的是，通过PINK1过表达或PINK1激动剂（如激动素和MTK458）处理来增强PINK1活性，挽救了UQCRC1相关帕金森病模型中的帕金森综合征样缺陷，这表明增强线粒体自噬是帕金森病的一种潜在治疗方法。该研究发表于《npj Parkinson's Disease》杂志，为理解帕金森病中线粒体功能障碍与质量控制机制的联系提供了重要证据，并指出了潜在的治疗方向。
研究人员为开展此项综合研究，主要应用了以下几项关键技术方法：1）基于19项公共基因表达数据库（GEO）的荟萃分析，涉及335例人死后黑质组织样本；2）利用UQCRC1 p.Y314S基因敲入（KI）的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞系进行体外功能验证；3）构建果蝇（Drosophila）帕金森病模型，通过RNA干扰（RNAi）技术实现神经元特异性uqcrc1敲低；4）采用2xCOX8-EGFP-mCherry和mito-QC两种荧光报告系统实时监测线粒体自噬流；5）通过蛋白质免疫印迹（Western blot）、免疫荧光染色、RNA测序（RNA-seq）和定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）进行分子水平检测；6）使用PINK1特异性激动剂（kinetin和MTK458）进行药理学干预实验。
Meta-analysis revealed that UQCRC1 expression is reduced in idiopathic PD
研究人员为了阐明UQCRC1在散发性帕金森病中的表达水平，对Gene Expression Omnibus（GEO）数据库进行了系统检索，最终纳入19个数据集，包含150例对照和185例帕金森病或 incidental Lewy body disease（iLBD）病例的黑质样本。荟萃分析结果显示，与正常个体相比，帕金森病患者黑质中UQCRC1 mRNA水平的估计平均log2倍变化为-0.2981，相当于降低了约20%，具有统计学显著性。异质性检验和发表偏倚分析均支持结果的可靠性。此外，对死后帕金森病患者全脑裂解物的蛋白质免疫印迹分析证实UQCRC1蛋白水平也降低。在携带家族性UQCRC1 p.Y314S突变的SH-SY5Y细胞中，UQCRC1蛋白同样减少。这些发现共同表明UQCRC1缺陷在家族性和散发性帕金森病中均存在，提示其可能是帕金森病中的一个常见现象。
UQCRC1 deficiency impairs mitophagy
鉴于线粒体自噬损伤与帕金森病密切相关，研究团队检测了UQCRC1相关帕金森病模型中的线粒体自噬是否减弱。他们使用了两种荧光报告基因（2xCOX8-EGFP-mCherry和mito-QC）来监测线粒体自噬流。在携带家族性UQCRC1 p.Y314S的SH-SY5Y细胞中，基础条件下指示酸化的mitolysosomes（红色荧光斑点）数量与对照细胞相似。但在用线粒体毒素寡霉素（oligomycin）和抗霉素A（antimycin A, OA）诱导线粒体自噬后，突变细胞产生的mitolysosomes少于对照细胞，表明UQCRC1突变削弱了线粒体自噬流。同样，在SH-SY5Y细胞中敲低UQCRC1也导致OA处理后mitolysosomes减少。在果蝇多巴胺能神经元中，特异性敲低uqcrc1也发现了mitolysosomes的减少，其程度与敲低关键自噬因子Atg5相当。这些结果在细胞和活体水平一致表明UQCRC1缺陷会损害线粒体自噬。
PINK1 is downregulated in UQCRC1-associated PD models
PINK1和PRKN是线粒体自噬的关键调节因子，也是著名的家族性帕金森病基因。研究团队进行了另一项荟萃分析，发现PINK1在散发性帕金森病中脑中也存在缺陷，而PRKN则没有。对纳入的17个数据集的分析显示，帕金森病黑质中PINK1 mRNA水平的估计平均log2倍变化为-0.3537，相当于降低了22%。进一步的相关性分析显示，在各个数据集中，UQCRC1和PINK1的mRNA水平之间存在强正相关。相反，UQCRC1和PRKN之间的相关性较弱。在UQCRC1 p.Y314S SH-SY5Y细胞中，RNA-seq证实PINK1 mRNA水平降低，而PRKN mRNA水平不变，这与荟萃分析结果一致。
UQCRC1 deficiency impairs the initiation of PINK/Parkin-mediated mitophagy
鉴于在UQCRC1相关模型中发现了PINK1下调，研究人员接着检测了与PINK1激活相关的分子事件是否受UQCRC1缺陷影响。他们在敲低UQCRC1的SH-SY5Y细胞中监测了Parkin的线粒体募集和泛素的磷酸化，这两个是PINK1/Parkin介导的线粒体自噬的特征性分子事件。UQCRC1敲低降低了OA诱导的Parkin线粒体募集程度，表明UQCRC1缺失阻碍了线粒体自噬过程中的Parkin激活。对丝氨酸65位点磷酸化泛素（p-Ub）的蛋白质免疫印迹检测显示，在野生型细胞中，OA处理后p-Ub随时间依赖性增加，但在UQCRC1缺失细胞中，p-Ub种类的积累受到抑制。这些数据表明，PINK1/Parkin介导的线粒体自噬的启动过程在UQCRC1缺陷时受到损害。
PINK1 overexpression is neuroprotective in UQCRC1-associated PD
先前研究表明，PINK1过表达在MPTP或α-突触核蛋白病诱导的帕金森病模型中具有神经保护作用。本研究探讨了PINK1过表达是否在UQCRC1相关的帕金森病模型中也提供类似效果。首先，发现在全神经元缺失uqcrc1的果蝇模型中，Pink1的表达水平也降低，而过表达Pink1挽救了uqcrc1 RNAi果蝇的攀爬缺陷。为了评估Pink1过表达是否恢复了线粒体自噬，研究人员使用mito-QC报告基因，并以每脑区mitolysosomes数量和mitolysosomes与线粒体含量的比率作为线粒体自噬流的指标。这两个参数在uqcrc1缺陷的果蝇脑中均降低，与SH-SY5Y细胞和果蝇多巴胺能神经元中的发现一致。而Pink1过表达逆转了这种线粒体自噬损伤。这些发现表明，增强PINK1功能可以改善UQCRC1相关帕金森病的表型缺陷。
PINK1 activators are neuroprotective in UQCRC1-associated PD
为了验证这一假设，研究团队测试了两种已知的PINK1激动剂（kinetin和MTK458）的处理是否在uqcrc1 RNAi果蝇和UQCRC1突变SH-SY5Y细胞中提供神经保护作用。他们发现MTK458改善了神经元uqcrc1缺陷果蝇的攀爬缺陷以及PPL1簇多巴胺能神经元的丢失。这种改善效应在Pink1缺失突变体中被削弱。此外，之前的研究表明UQCRC1突变导致SH-SY5Y细胞神经突长度缩短。在UQCRC1敲低细胞中也观察到类似的神经突缩短现象。MTK458在这两种模型中均挽救了该缺陷，并改善了线粒体自噬。Kinetin也以剂量依赖的方式表现出类似的益处。这些结果共同证明，使用PINK1激动剂可能是治疗以UQCRC1缺陷为特征的帕金森病的一种策略。
本研究通过对死后脑数据集的荟萃分析，发现UQCRC1在帕金森病中表达降低，表明UQCRC1不仅仅是一个与罕见家族性帕金森病相关的基因，其表达水平也可作为帕金森病的生物标志物，并在帕金森病发病机制中具有潜在作用。先前研究显示UQCRC1缺陷导致细胞色素c释放到胞质并诱导细胞凋亡。本研究则证明UQCRC1缺陷还导致线粒体自噬受损。研究发现UQCRC1表达水平与人类黑质中PINK1水平呈正相关，这一发现在果蝇和细胞培养模型实验中得到了进一步支持。研究人员能够证明Pink1过表达挽救了uqcrc1敲低果蝇的运动和线粒体自噬缺陷。用PINK1激动剂kinetin和MTK458处理在果蝇和细胞培养模型中均产生了有益效果，提示了PINK1激动剂在治疗UQCRC1相关的家族性和散发性帕金森病方面的潜力。
研究提出了氧化磷酸化应激作为帕金森病中线粒体自噬受损的病因。随着大脑衰老，与线粒体呼吸链、氧化磷酸化和线粒体自噬活性相关的蛋白表达水平随时间变化。最近一项小鼠研究表明，在多巴胺能的黑质纹状体神经元中，老年时期的线粒体自噬流增强，表明衰老过程中神经元对线粒体自噬的依赖性增加以维持其完整性。换句话说，衰老的神经元变得对线粒体自噬不足更敏感。本研究显示，由UQCRC1突变或缺陷导致的氧化磷酸化应激损害了线粒体自噬，尤其是在损伤后对线粒体更新需求增加时。这些结果为氧化磷酸化应激与帕金森病发病机制之间的关键联系提供了证据。
研究也存在一些局限性。首先，虽然分析了来自两个独立来源的脑裂解物数据，且关于帕金森病中UQCRC1水平的数据一致，但更广泛的患者入组和额外的脑裂解物分析将显著增加研究结果的可信度。其次，工作确定了UQCRC1缺陷与PINK1下调之间的相关性，但直接将UQCRC1缺失与PINK1缺陷联系起来的详细分子机制仍有待阐明。实验验证过的调节PINK1表达的因子包括ATF3、p53、sirtuins和NRF1。像ATF3和p53这样的抑制因子已知会抑制PINK1。有趣的是，虽然据报道p53在帕金森病脑中水平上调，但ATF3 mRNA下调，提示体内存在复杂且背景特异性的调控。相反，sirtuins和NRF1是PINK1转录的正向调节因子。Sirtuins是一类NAD+依赖的去乙酰化酶，包括SIRT1-7。依赖于SIRT1或SIRT3的FOXO3去乙酰化对于PINK1转录至关重要。在帕金森病死后脑中，发现一些多巴胺能神经元中SIRT3和PINK1水平同时降低。NRF1是一种响应线粒体应激的转录因子。帕金森病脑中也报道了NRF1减少，提示PINK1下调。目前尚不清楚SIRT3-FOXO3-PINK1和NRF1-PINK1轴的失调是否有助于UQCRC1帕金森病模型的分子病因，需要进一步研究来确定哪个调节轴负责观察到的PINK1降低。
PINK1长期以来被认为是帕金森病的潜在治疗靶点。已经开发了几种激活剂，尽管对其结构兼容性或特异性存在一些担忧，但重要的是，它们已被证明能激活PINK1/Parkin介导的线粒体自噬。在精准医疗时代，可以预期PINK1激活剂可用于表现出氧化磷酸化缺陷的患者，例如那些具有UQCRC1缺陷的患者。
总而言之，该研究证明UQCRC1缺陷在不同数据集的帕金森病患者中广泛存在。研究还表明UQCRC1缺陷与PINK1依赖性线粒体自噬损伤相关，拓宽了我们对氧化磷酸化缺陷在帕金森病发病机制中作用的理解。作为概念验证，研究显示PINK1激动剂在改善UQCRC1相关帕金森病细胞和果蝇模型的表型缺陷方面产生了有益效果。这些观察结果表明，具有氧化磷酸化缺陷的帕金森病患者可能受益于激活PINK1的治疗，为未来的帕金森病精准治疗提供了新的见解。
