《npj Regenerative Medicine》：Activated Hedgehog signaling in keratocytes leads to stromal stiffness and impairs corneal regeneration
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本研究针对角膜损伤修复中基质透明度难以恢复的临床难题，揭示了角膜基质细胞中Hedgehog信号通路的病理激活会驱动细胞表型转化，导致胶原纤维紊乱、基质硬化，进而通过Hippo-YAP轴抑制上皮分化。通过基因敲除和药物抑制实验，证实靶向Hedgehog通路可逆转上述缺陷，为化学烧伤等难治性角膜损伤提供了新的治疗策略。
眼睛是心灵的窗户，而角膜作为眼球最外层的透明组织，既是光线进入眼内的第一道关口，也是保护眼内结构的屏障。然而，这片仅有0.5毫米左右的脆弱组织，却常常面临严峻挑战——物理刮擦、化学烧伤、感染炎症……轻则影响视力，重则导致失明。在各类角膜损伤中，化学烧伤尤为凶险，强碱或强酸物质可在瞬间摧毁角膜的精密结构，即便侥幸保住眼球，也常因组织修复异常而形成瘢痕、血管增生，最终失去透明性。为什么有些浅表损伤能迅速愈合、不留痕迹，而深层损伤却容易走向纤维化和混浊？这个问题的答案，很大程度上藏在角膜的“骨架”——基质层中。
角膜基质由规则排列的胶原纤维和散在分布的基质细胞构成，其独特的有序结构是维持透明的关键。在正常状态下，基质细胞处于静息状态，分泌胶原蛋白、蛋白聚糖等细胞外基质成分，默默支撑着上皮层的更新和功能。一旦损伤深入基质，静息的基质细胞便被激活，若不能及时恢复静息，便会转化为成纤维细胞样细胞，分泌紊乱的基质成分，导致瘢痕形成。然而，驱动这一病理转化的核心信号通路究竟是什么？能否通过干预该通路促使基质恢复有序结构？这些问题一直是角膜再生领域的未解之谜。
近日，发表于《npj Regenerative Medicine》的一项研究为这一难题提供了重要线索。上海交通大学医学院附属新华医院眼科的李静、赵培泉团队与合作者发现，一条在胚胎发育中至关重要的信号通路——Hedgehog通路，在成年角膜基质细胞中本应保持沉默，却在化学烧伤后被异常激活，进而通过改变基质的生物力学特性，阻碍上皮细胞分化，最终破坏角膜的完整再生。该研究不仅揭示了基质细胞中Hedgehog信号在角膜稳态维持中的新功能，更提出了靶向该通路治疗难治性角膜损伤的创新策略。
为开展本研究，作者团队运用了多种关键技术：利用Prrx1-CreERT等诱导型基因敲除小鼠实现基质细胞特异性基因操作；通过RNA测序分析差异表达基因；采用原子力显微镜量化基质刚度；结合免疫荧光、Western blot、透射电镜等技术进行表型验证；并使用Gli1/2抑制剂GANT61和Hippo通路抑制剂XMU-MP-1进行药理干预。
研究结果
1. Hedgehog信号在角膜基质细胞中随发育逐渐沉默
研究人员发现，Hedgehog通路的关键转录因子Gli1和Gli2的表达在小鼠出生后显著下降，至成年期维持在极低水平。免疫组化和Western blot结果一致显示，Gli1蛋白在成年基质细胞中几乎检测不到。利用基质细胞特异性标记Prrx1-CreERT构建的Smo条件性敲除小鼠角膜形态正常，说明成年角膜基质细胞中Hedgehog信号处于生理性静默状态。
2. 化学损伤特异性激活基质细胞中的Hedgehog信号
在碱烧伤模型中，Gli1和Gli2的mRNA和蛋白水平均显著上调，且持续至伤后14天。利用Gli1-CreERT谱系示踪技术，证实化学损伤后Gli1阳性细胞仅出现在基质层，而刮擦损伤则无此现象。进一步机制探讨发现，化学损伤后高表达的炎症因子TNF-α是激活Hedgehog信号的关键诱因。
3. 激活Hedgehog信号损害角膜损伤修复
在基质细胞特异性敲除Ptch1（Hedgehog通路抑制因子）的小鼠中，虽然上皮刮伤后早期创面闭合正常，但上皮分化受阻：分层减少、分化标志物K12表达下降、祖细胞标志物K14持续表达。增殖细胞数量无变化，提示分化缺陷是主要问题。
4. Hedgehog信号活化改变基质细胞属性并破坏胶原纤维组织
RNA测序显示，Ptch1缺失导致基质细胞基因表达谱重编程，表现为角膜基质细胞标志物（如Kera、Aldh3a1）下调，而成纤维细胞标志物（如Acta2、Vim）上调。细胞外基质相关基因，特别是胶原纤维组织相关基因广泛下调。免疫荧光和透射电镜进一步证实胶原I和角膜特异性蛋白聚糖keratocan减少，胶原纤维排列致密、紊乱。
5. Hedgehog信号活化导致角膜基质硬化
原子力显微镜检测显示，Ptch1缺陷角膜的弹性模量显著增加（约110%），表明基质刚度升高。
6. 基质硬化通过抑制YAP信号阻滞上皮分化
上皮细胞RNA测序提示Hippo通路激活。免疫组化和Western blot证实YAP核定位减少，磷酸化YAP和LATS1增加。局部应用Hippo抑制剂XMU-MP-1可恢复YAP活性并挽救上皮分化缺陷，而YAP抑制剂Verteporfin则能模拟上皮分化障碍表型。
7. 抑制Hedgehog信号可预防角膜缺陷
在Ptch1敲除小鼠中，口服Gli1/2抑制剂GANT61能恢复角膜结构和上皮分化。在化学损伤模型中，基质细胞特异性Smo敲除或局部应用GANT61均能显著改善损伤修复，恢复基质和上皮的正常形态。
结论与意义
本研究系统阐明了角膜基质细胞中Hedgehog信号的病理激活是损害角膜再生的重要机制。在生理状态下，该信号通路的沉默是维持基质细胞静息和角膜透明的必要条件；而在化学损伤等严重刺激下，炎症因子（尤其是TNF-α）驱动Hedgehog信号异常活化，促使基质细胞转化为成纤维细胞样细胞，破坏胶原分泌和排列，增加基质刚度，进而通过Hippo-YAP轴抑制上皮分化。值得注意的是，遗传或药物抑制Hedgehog信号均可逆转上述病理改变，提示靶向该通路具有治疗潜力。
这一发现不仅深化了对角膜基质-上皮细胞对话机制的理解，更为临床难治性角膜损伤（如化学烧伤、糖尿病角膜病变）提供了新的干预思路。在糖尿病等慢性疾病状态下，持续的低度炎症可能同样导致Hedgehog信号轻度活化，参与慢性伤口愈合障碍的发生。因此，调控基质细胞Hedgehog活性有望成为促进角膜透明再生、避免瘢痕形成的有效策略。
