《Scientific Reports》：In vitro effects of Bacillus velezensis strain Mandacaium against Xanthomonas citri pv. glycines: genomic and metabolomic insights
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本研究针对大豆细菌性斑疹病（由Xanthomonas citri pv. glycines引起）的可持续防控需求，从无刺蜂幼虫食物中分离获得一株贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）Mandacaium菌株。研究发现其代谢产物（主要为二酮哌嗪类化合物）在体外对病原菌具有显著抑制活性（CDI=0.015 mg/mL），且对大豆种子无急性毒性。基因组分析揭示该菌株含有13个次级代谢产物生物合成基因簇。该研究为开发基于微生物代谢产物的新型生物农药提供了候选菌株和理论基础。
大豆作为全球重要的粮食和经济作物，其生产常受到多种病害的威胁，其中由野油菜黄单胞菌大豆致病变种（Xanthomonas citri pv. glycines, Xcg）引起的大豆细菌性斑疹病（Bacterial pustule）可导致严重产量损失，在热带地区减产可达40%以上。长期以来，化学农药的过度使用在控制病害的同时，也带来了病原菌抗药性、环境污染以及对非靶标生物的影响等一系列问题。因此，开发高效、环境友好的替代防控策略，特别是利用生物防治剂，已成为农业可持续发展的重要研究方向。在众多有益的微生物中，芽孢杆菌属（Bacillus）细菌，尤其是贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），因其能够产生多种抗菌物质（如抗生素、抗真菌物质和脂肽等）而显示出巨大的生防潜力。然而，从特殊生态位（如昆虫相关环境）中挖掘具有独特代谢特征和高效生防活性的菌株资源，仍是当前研究的重点之一。
在这项发表于《Scientific Reports》的研究中，由Joberth Lee Correa等人组成的研究团队，将目光投向了巴西无刺蜂（Melipona quadrifasciata）的幼虫食物这一复杂的微生物资源库。他们推测，这种充满微生物竞争的环境中可能蕴藏着能够产生强效抗菌物质的菌株。研究人员从中分离得到一株贝莱斯芽孢杆菌，命名为Mandacaium菌株，并综合运用体外抗菌试验、代谢组学分析和全基因组测序等技术，系统评估了其对大豆细菌性斑疹病原体Xcg的抑制潜力、活性物质的化学基础及其生物合成遗传潜能。
为开展本研究，作者主要运用了几项关键技术：1) 体外抗菌活性测定（琼脂扩散法）用于筛选和验证菌株发酵上清液及其不同溶剂萃取组分（如乙酸乙酯提取物）对Xcg的抑制效果；2) 液相色谱-二极管阵列检测器-串联质谱联用（UFLC-DAD-MS/MS）技术用于对活性提取物中的代谢产物进行初步鉴定和注释；3) 全基因组测序与生物信息学分析（包括antiSMASH软件预测次级代谢产物生物合成基因簇，以及平均核苷酸一致性（ANI）分析进行物种鉴定和基因组比较）；4) 大豆种子发芽毒性试验，以评估菌株发酵上清液的植物安全性。研究所用细菌菌株分离自无刺蜂幼虫食物样本。
研究结果
抗菌试验
在初步筛选的十株细菌发酵上清液中，仅贝莱斯芽孢杆菌Mandacaium菌株（编号Mq-OAT-27）的上清液对Xcg表现出显著的抑制作用（p = 0.0164）。进一步分级分离表明，抗菌活性主要存在于代谢物组分中，而非蛋白质组分。通过液-液分配，发现活性物质富集在乙酸乙酯提取物中，其对Xcg的浓度依赖性抑制（CDI）浓度为0.015 mg/mL。
大豆种子发芽毒性试验
用贝莱斯芽孢杆菌Mandacaium菌株的发酵上清液处理大豆种子，与用水处理的对照组相比，对种子的正常发芽率未产生显著影响（卡方检验，p ≈ 0.51），表明在该实验条件下，该上清液对大豆种子无急性毒性。
代谢物初步鉴定
对具有抗菌活性的乙酸乙酯提取物进行LC-MS分析，初步注释出15种代谢物。其中，主要成分为二酮哌嗪类（Diketopiperazines, DKPs），例如环（组氨酰-脯氨酸）[Cyclo-(histidyl-proline)]、环（脯氨酰-酪氨酸）[Cyclo-(prolyl-tyrosine)]及其多种异构体。此外，还检测到一些结构更复杂的脂质相关分子，如十六碳二氢鞘氨醇（Hexadecasphinganine）和羟基二氢鞘氨醇（Hydroxysphinganine）。值得注意的是，分析并未检测到基因组预测的典型脂肽或聚酮化合物。
基因组组装与生物信息学分析
对贝莱斯芽孢杆菌Mandacaium菌株进行全基因组测序，获得一个大小约为4.04 Mb的基因组草图。平均核苷酸一致性（ANI）分析确认其属于贝莱斯芽孢杆菌。通过antiSMASH软件预测到13个与次级代谢产物生物合成相关的基因簇，包括可能负责合成表面活性素（surfactin，非核糖体肽，NRPS）、杆菌霉素（bacillaene，聚酮化合物+非核糖体肽，transAT-PKS, T3PKS, NRPS）、芬荠素（fengycin，非核糖体肽，NRPS, transAT-PKS, betalactone）、迪菲西丁（difficidin，聚酮化合物，transAT-PKS）等已知抗菌物质的基因簇。然而，这些基因簇所对应的产物在本次分析的提取物中未被检测到。基因组中还预测到两个抗菌素抗性基因cfr(B)和tet(L)。蛋白质相互作用网络分析揭示了与代谢物产生和耐药性相关的基因之间存在潜在关联。
讨论与结论
本研究成功从无刺蜂幼虫食物中分离并鉴定了一株新的贝莱斯芽孢杆菌Mandacaium菌株。体外实验证实其产生的代谢物，特别是富集在乙酸乙酯组分中的物质，对大豆重要病原菌Xcg具有抑制活性。代谢组学分析表明，在实验条件下，二酮哌嗪类化合物是该菌株提取物中的主要可检测成分。尽管全基因组分析揭示了该菌株具有合成多种已知抗菌脂肽和聚酮类化合物的强大遗传潜力（如surfactin, fengycin, bacillaene, difficidin等），但这些化合物在本次分析的提取物中并未被检测到，提示它们的表达可能受到培养条件、生长阶段或环境因素的严格调控。
该研究的重要意义在于：首先，发现了一个源自特殊生态位（无刺蜂幼虫食物）的贝莱斯芽孢杆菌新菌株，其代谢产物对大豆细菌性斑疹病原菌有体外抑制活性，且对大豆种子安全，为开发针对该病害的新型生物防治剂提供了潜在的菌种资源。其次，结合基因组和代谢组学分析，不仅揭示了观察到的抗菌活性的可能化学基础（二酮哌嗪类），更全面展示了该菌株尚未被充分利用的生物合成潜力，为后续通过优化培养条件或基因工程手段激活特定基因簇、定向获取目标活性化合物（如脂肽、聚酮）奠定了基础。最后，研究强调了特殊生境微生物在挖掘新型生物活性物质方面的价值。
总之，这项研究通过多组学方法初步阐明了贝莱斯芽孢杆菌Mandacaium菌株的抗植物病原菌活性和其代谢背景，为后续更深入的功能研究（如关键活性物质的分离鉴定、作用机制解析）以及开发用于可持续农业病害管理的微生物源产品迈出了重要的第一步。未来的研究需要包括体内（in planta）功效验证、环境安全性评估以及活性化合物的大规模生产和制剂化研究。
