《Nature Communications》：DNA end configurations dictate synaptic complex formation during NHEJ-mediated end bridging
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本研究针对非 homologous 末端连接（NHEJ）修复DNA双链断裂（DSB）过程中，不同DNA末端构型如何影响突触复合物形成这一关键科学问题，利用单分子FRET（smFRET）技术，揭示了末端微同源性在促进Ku70-Ku80（Ku）与XRCC4-DNA连接酶IV（X4L4）形成紧密突触（CS）复合物中的决定性作用，发现≥3 nt的微同源性可替代XLF功能直接驱动CS形成，阐明了末端构型调控NHEJ修复效率与保真度的新机制，对理解基因组稳定性维持具有重要意义。
在细胞的生命活动中，DNA双链断裂（DSB）是最为严重的DNA损伤类型之一，它可能由细胞内正常的代谢活动等内源性因素引起，也可能来自外界基因毒性物质的攻击。如果未能得到及时修复，DSB会导致细胞周期停滞、程序性死亡或衰老。面对这一威胁，细胞进化出了两套主要的修复工具：同源重组（HR）和非 homologous 末端连接（NHEJ）。其中，NHEJ因其无需模板即可直接连接断裂末端，且在整个细胞周期中均可发挥作用，成为哺乳动物体细胞修复DSB的主要途径。然而，NHEJ过程的一个关键且迷人的步骤——将两个断裂的DNA末端在物理上拉近并“桥接”起来，即所谓的“突触”过程——其具体机制，尤其是具有复杂多样的末端构型（而非理想化的平末端）的DNA是如何完成突触的，长期以来并不清楚。
以往的研究多使用平末端DNA底物来解析NHEJ突触的核心蛋白组分，这帮助我们认识到Ku、X4L4和XLF等核心蛋白的重要性，并提出了柔性突触（FS）和紧密突触（CS）复合物的两阶段模型。但现实生物体内产生的DSB末端千变万化，平末端只占很小一部分，更多的末端带有粘性、损伤碱基或微小的同源序列。这些不同的“末端样貌”是否会影响突触复合物的形成方式、结构乃至对核心蛋白的依赖性？为了回答这个问题，西安交通大学等单位的研究人员在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。
研究人员巧妙地运用单分子FRET（smFRET）这一高分辨率技术，如同给分子世界安装上了“实时监控”，直接观察不同末端构型的DNA在核心NHEJ蛋白（Ku, X4L4, 伴有或不伴有XLF）作用下进行突触的动态过程。他们发现，DNA末端的“样貌”堪称突触路径的“总指挥”。当末端存在至少3个核苷酸（nt）的微同源序列时，Ku和X4L4两者就足以高效地介导从FS到CS复合物的转变，而此前在平末端模型中必需的辅因子XLF在此情况下变得“非必需”。这意味着，末端自身的微同源性能够“替代”XLF的功能，为CS复合物的形成和稳定提供了足够的能量。进一步对CS复合物结构的FRET分析揭示，末端之间存在至少两种不同的紧密接触模式：一种是末端单链直接配对形成的“末端配对”CS复合物，另一种更为常见的则是双链-单链连接处紧密接触，而单链悬垂像“小翅膀”一样向外翻出的“连接处接触”CS复合物。这种翻出的构象可能为Artemis等核酸酶对不兼容末端的修剪处理提供了空间灵活性。对于微同源性小于3 nt的末端，XLF则仍然是驱动FS向CS转变的关键因子。此外，研究还证实5‘末端的磷酸化修饰以及常见的氧化损伤碱基8-氧代鸟嘌呤对突触效率的影响有限。这些发现系统地阐明了DNA末端构型如何通过调控突触复合物的形成路径和结构，进而决定NHEJ修复的效率和结局。
主要关键技术方法
本研究主要依托单分子荧光共振能量转移（smFRET）技术，在全内反射荧光显微镜（TIRFM）搭建的平台上，实时观测并分析由纯化的核心NHEJ蛋白（Ku70/80, XRCC4-DNA连接酶IV, XLF）介导的、带有不同末端构型（如平末端、不同长度和序列的互补粘性末端、含8-氧代鸟嘌呤的末端等）的DNA双链的突触过程。通过分析FRET效率（EFRET）的分布、动态转换和停留时间，来表征突触复合物的类型（FS vs CS）、结构状态和稳定性。辅以体外 ensemble NHEJ连接实验，验证突触复合物的连接活性。所有蛋白通过昆虫细胞或293T细胞表达系统进行重组表达和纯化。
DNA末端构型影响NHEJ突触
研究人员首先验证了其smFRET系统对平末端突触的分析能力，结果与先前研究一致：Ku与X4L4可介导形成FRET值较低（~0.1）的柔性突触（FS）复合物，而XLF的加入能显著促进形成FRET值较高（~0.8）的紧密突触（CS）复合物。对比实验发现，具有互补3‘悬末的DNA，仅凭Ku和X4L4就能实现与加入XLF时相当的连接效率，表明末端互补性可以替代XLF的功能。smFRET成像直接证实，Ku和X4L4对互补悬末的突触效率比平末端高出约2.5倍，且XLF的加入对其影响甚微。
兼容性悬末促进不依赖于XLF的CS形成
对具有互补3‘ GGGG/CCCC悬末的DNA进行突触分析，发现其FRET轨迹呈现出四种 distinct 状态，对应的FRET分布峰值为0.76（E4）， 0.58（E3）， 0.39（E2）和0.13（E1）。其中E4和E1分别与平末端在Ku, X4L4, XLF存在下形成的CS和FS复合物对应，表明Ku和X4L4在无XLF时，也能利用互补悬末高效形成FS和CS复合物。使用不同序列（如ACTG/CAGT， TTTT/AAAA）的互补悬末也得到了类似结果，说明这种能力主要由末端互补性而非碱基组成决定，但富含A/T的序列其CS形成效率较低且仍部分依赖XLF，提示碱基组成起调节作用。
DNA兼容性悬末形成两种结构不同的CS复合物
通过比较与预连接的不同长度参比DNA的FRET值，研究人员推断出CS复合物的两种主要构型：一种是“连接处接触”构型（E4， FRET ~0.76），即两个DNA双链的ssDNA-dsDNA连接处直接接触，悬垂单链向外翻出；另一种是“末端配对”构型（E3， FRET ~0.58-0.55），即悬垂单链通过部分或全部碱基配对相连，中间可能留有缺口或间隙。动态轨迹分析显示，末端配对CS复合物（E3）可以直接形成，或由FS复合物转换而来，而连接处接触CS复合物（E4）则通常由E3状态转换形成，突出了末端配对在CS形成中的核心地位。研究还发现，在悬末中引入常见的氧化损伤碱基8-氧代鸟嘌呤，对Ku和X4L4介导的突触效率和CS形成稳定性影响很小。
至少需要三个互补碱基对才能由Ku和X4L4实现高效的CS形成
通过系统测试具有1到3个互补碱基对（G/C, GG/CC, GGG/CCC）的悬末，发现只有当互补性达到3 nt（GGG/CCC）时，Ku和X4L4才能有效促进CS复合物（E3和E4状态）的形成，其FRET分布与四碱基对悬末相似。而对于≤2 nt的悬末，主要只形成FS复合物。定量分析表明，CS复合物的比例仅在悬末互补性≥3 nt时显著增加。三碱基对的微同源性已足以形成稳定的CS复合物，即使其嵌入更长的部分不兼容序列（GGGTT/CCCTTT）中，虽效率与稳定性有所下降，但CS复合物依然能够形成。
XLF促进互补性有限的悬末的CS形成
对于互补性有限的悬末（如G/C, GG/CC），XLF的加入能够显著促进CS复合物的形成，其FRET分布出现高FRET峰（~0.68）。对于更长的互补悬末（GGG/CCC, GGGG/CCCC），XLF进一步提高了CS复合物（尤其是连接处接触构型）的比例。在所有测试的底物上，XLF均增加了CS复合物相对于FS复合物的丰度，并且CS的丰度与悬末长度（即微同源性长度）正相关。XLF还能显著增强部分兼容悬末（GGGTT/CCCTTT）的CS形成效率和稳定性。然而，CS复合物的停留时间在不同条件下（有无XLF，不同悬末长度）无显著差异。
DNA末端化学性质影响CS形成
研究还探讨了5‘末端磷酸化（5’ P）对突触的影响。发现5‘ P能显著提高互补性≥2 nt的悬末的突触效率。对于磷酸化的GG/CC悬末，Ku和X4L4能够形成CS复合物（包括E3和E4状态），而这在非磷酸化的同样序列中是无法实现的，表明末端磷酸化与碱基配对协同促进了CS形成。即使只有一个末端磷酸化也能促进CS形成。并且，在这些条件下形成的CS复合物能够抵抗高盐洗涤，说明其内部发生了共价连接，是具备连接活性的。
该研究最终提出了一个依赖于末端构型的NHEJ突触模型：DSB发生后，Ku结合末端并招募X4L4形成FS复合物，允许末端松散地搜寻微同源性。当存在≥3 nt微同源性时，末端配对提供的能量足以驱动FS向CS（末端配对或连接处接触构型）的转变，无需XLF。而当微同源性不足（<3 nt）时，此转变则依赖于XLF。此外，5‘末端磷酸化也能与有限的碱基配对（如2 nt）协同，在无XLF时促进CS形成。在连接处接触CS复合物中，翻出的悬垂为后续可能的不兼容序列处理（如Artemis切割）提供了灵活性，而复合物最终需转换至缺口包含的CS状态以完成连接。
这项研究深刻揭示了DNA末端自身的物理和化学特性（构型、序列、化学修饰）是选择NHEJ突触路径的关键决定因素。这种机制的多样性使NHEJ修复系统能够灵活高效地应对细胞内千变万化的DSB末端结构，为理解基因组稳定性维持、V(D)J重组、抗体类型转换以及基因组编辑工具（如CRISPR-Cas9）产生的末端修复结局提供了重要的理论基础。
