《Nature Communications》：Spatiotemporally controlled drug release via a click-release system utilizing mono-alkyl-hydroxylamine and cyclooctyne chemistry
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本研究针对传统生物正交点击化学"始终激活"特性导致的时空控制精度不足问题，开发了一种基于单烷基羟胺与环辛炔(COT)反应的刺激响应型点击释放平台。通过将羟胺的点击活性与可裂解基团偶联，实现了在谷胱甘肽(GSH)富集肿瘤微环境或光照射下的精准药物释放。在4T1小鼠乳腺癌模型中，该策略显著增强了阿霉素的肿瘤靶向性并降低系统暴露；在局部麻醉应用中，通过405 nm光调控实现了可重复的按需镇痛。这项研究为精准医疗提供了新型化学工具。
在化学与生物学的交叉领域，点击化学以其卓越的反应选择性和效率彻底改变了生命科学的研究范式。然而，传统生物正交反应平台存在一个关键瓶颈：其固有的"始终激活"特性限制了在复杂生物环境中实现精确时空控制的可能性。虽然四嗪(Tz)与反式环辛烯(TCO)介导的点击释放策略在肿瘤成像和前药治疗等领域取得显著进展，但现有方法仍主要集中于四嗪支架的修饰，开发可控激活的生物正交反应平台成为该领域的重要前沿。
针对这一挑战，中国药科大学郑月钦、郭伟伟团队在《Nature Communications》发表了一项创新研究，他们巧妙利用单烷基羟胺与环辛炔(COT)的反应特性，构建了一个兼具快速动力学、高释放效率和精确时空控制能力的点击释放系统。研究人员发现，单烷基羟胺与环辛炔反应形成羟基氨基辛烯中间体，当在COT的炔丙位引入离去基团时，该中间体发生快速1,4-消除，实现近乎定量的有效载荷释放。更重要的是，通过氨基甲酸酯连接掩蔽羟胺的点击活性，使其能够被特定刺激（如升高的谷胱甘肽、酶活性或光照）激活，从而实现对释放过程的精确控制。
本研究主要采用以下关键技术方法：通过高效液相色谱(HPLC)和核磁共振(1H NMR)监测反应动力学与机理；利用细胞成像技术验证生物正交反应在4T1乳腺癌细胞中的效率；构建4T1小鼠乳腺癌模型评估肿瘤靶向治疗效果；使用热敏水凝胶载体实现局部麻醉药物的可控释放；通过UPLC-MS/MS进行药代动力学分析。
羟胺和单烷基羟胺与COT的加氢胺化反应
研究人员系统研究了羟胺衍生物与COT的基本反应性。机理研究表明，单烷基羟胺与COT通过逆Cope消除形成烯胺N-氧化物中间体，随后发生质子转移生成硝酮。定量HPLC分析显示，在室温下50%乙腈/PBS溶液中，单烷基羟胺2c与COT 1a反应30分钟转化率达81%，2小时后接近99%。相比之下，羟胺2a在相同条件下反应30分钟仅实现41%转化，这归因于其较低的亲核性。研究人员还评估了一系列羟胺衍生物的反应性，发现氧原子质子被取代或空间位阻增大的衍生物完全丧失反应活性。
生物正交单烷基羟胺/COT键断裂化学
为验证该反应在触发分子释放中的应用潜力，研究人员以对硝基苯胺为模型分子，合成了COT 3a。实验表明，单烷基羟胺2c与3a在20%乙腈/PBS溶液中反应，对硝基苯胺释放率高达97.9%。1H NMR监测发现，消除中间体3b不可检测，表明一旦形成即快速消除释放 payload。该反应展现出优异的区域选择性，确保近乎完全的载荷释放。
点击释放策略在细胞环境中的有效性
在4T1乳腺癌细胞中，笼蔽探针4b和4c（20μM）孵育60分钟未观察到荧光信号，而加入单烷基羟胺2c（100μM）后，共聚焦显微镜显示蓝色（4b）和绿色（4c）荧光显著增强。近红外探针5a也验证了细胞内反应效率。在前药激活方面，阿霉素通过氨基甲酸酯键与环辛炔醇偶联得到前药5c，其与2c共同处理4T1细胞后，细胞增殖抑制活性接近游离阿霉素水平，证实点击释放策略在细胞环境中的有效性。
时空可控的点击释放化学
通过氨基甲酸酯键连接响应性裂解基团，研究人员设计了三种羟胺衍生物：硫醇响应型6a、光激活型6b和硝基还原酶响应型6c。实验表明，6a可被2 mM谷胱甘肽激活，实现98%以上的4d释放；在4T1细胞中，6a与探针4c共孵育2小时后显示显著绿色荧光，而用N-乙基马来酰亚胺耗尽内源性GSH后荧光微弱。光激活系统在405 nm LED照射下，6b的点击活性被激活，实现超过98%的4d释放。
GSH触发的生物正交前药用于靶向癌症治疗
在4T1小鼠乳腺癌模型中，前药5c（2.4 mg/kg，阿霉素当量）与6a（17 mg/kg）联合静脉注射，每两天给药一次共四次注射。结果显示，5c+6a组合显著抑制肿瘤生长，效果优于游离阿霉素组。组织学分析显示，联合治疗组肿瘤组织坏死和凋亡水平显著升高。药代动力学研究表明，与游离阿霉素相比，6a+5c组在非靶组织（如心脏和肝脏）和血浆中的药物水平显著降低，而在肿瘤中保持相当浓度，证实点击释放反应优先在肿瘤微环境中被内源性GSH触发。
光触发生物正交前药用于局部麻醉
作为概念验证，研究人员设计了光触发前药系统用于局部麻醉。丁卡因通过氨基甲酸酯键与COT偶联得到前药7a。体外研究表明，在405 nm LED照射和光激活剂6b存在下，7a在30分钟内以89.4±2.4%的产率释放丁卡因。将7a和6b纳入温敏水凝胶制剂P407-(6b+7a)中，注射到大鼠足底后，通过调节光强和曝光时间可调控麻醉效果。300 mW cm-2照射5分钟可产生48.8±7.5分钟的神经阻滞，且可实现多达四次有效激活。
该研究建立的模块化激活策略可与生物正交级联放大系统整合，在深层或异质性组织中实现增强的信号或药物释放。与在高度还原环境中不稳定的四嗪不同，基于羟胺的化学表现出稳定性甚至受益于GSH，使其特别适用于还原性肿瘤微环境。该平台与Tz/TCO反应的正交性为未来复杂生物环境中的多重治疗或诊断策略奠定了基础，凸显了化学多样性和正交激活平台在开发下一代化学生物学工具和药物递送系统中的重要性。
