《Nature Communications》：Reduction of RAD23A extends lifespan and mitigates pathology in a mouse model of TDP-43 proteinopathy
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本文推荐一项发表于《Nature Communications》的研究。针对TDP-43蛋白病变这一神经退行性疾病的核心病理特征，研究人员探讨了降低RAD23A表达的治疗潜力。研究发现，在TDP-43蛋白病变小鼠模型中，通过反义寡核苷酸(ASO)或基因手段减少RAD23A，能显著延长小鼠寿命、改善运动行为、减轻神经病理变化，并减少TDP-43的错误定位和聚集。其机制涉及改善泛素-蛋白酶体系统(UPS)功能、重塑不溶性蛋白质组组成以及逆转TDP-43引起的转录组紊乱。该研究揭示了RAD23A在TDP-43毒性中的关键作用，为治疗肌萎缩侧索硬化(ALS)、额颞叶痴呆(FTD)等相关疾病提供了新的潜在靶点。
在神经退行性疾病（NDD）的复杂画卷中，蛋白质错误折叠和异常聚集是两大标志性特征。其中，TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）的异常行为尤为引人关注。在肌萎缩侧索硬化（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）等疾病中，TDP-43会从细胞核中“消失”，错误地聚集在细胞质中，形成有毒的聚集体。这不仅导致TDP-43正常的RNA代谢功能丧失（功能丧失，LOF），其异常聚集本身还会产生毒性（功能获得，GOF），共同推动疾病进程。因此，寻找能够干预TDP-43病理过程的有效策略，是当前神经科学领域的一大挑战。
以往的研究在线虫和组织培养模型中曾发现，一个名为RAD23的基因的缺失，能够抑制TDP-43引起的病理表型。RAD23在脊椎动物中有两个同源蛋白：RAD23A和RAD23B。它们通常被认为是“穿梭因子”，负责将泛素化标记的底物蛋白运送到蛋白酶体进行降解。然而，故事并非如此简单，RAD23功能的复杂性暗示着它在TDP-43蛋白病变中可能扮演着更微妙的角色。那么，在更接近人类的哺乳动物模型中，干预RAD23A或RAD23B是否能带来同样的益处？其背后的分子机制又是怎样的？这些问题对于评估其治疗潜力至关重要。由Robert G. Kalb领导的国际合作团队在《Nature Communications》上发表的研究，正是对这些问题进行的深入探索。
研究人员主要利用了表达野生型人源TDP-43的TAR4/4转基因小鼠模型，该模型能模拟人类ALS/FTD的许多关键病理特征。他们综合运用了反义寡核苷酸（ASO）介导的基因敲低、CRISPR/Cas9基因敲除、转录组学（RNA-Seq）、蛋白质组学（LC-MS/MS）、组织病理学分析、生化分级（如核质分离、Sarkosyl溶解度分析）以及蛋白酶体活性测定等一系列关键技术方法。其中，小鼠模型是研究核心，ASO用于特异性敲低基因，多种组学技术用于全局性分析分子变化，而生化分析则深入探讨了TDP-43的定位、聚集状态以及蛋白酶体功能。
减少RAD23A丰度有益于TDP-43蛋白病变模型
研究人员首先设计并验证了能够特异性敲低小鼠RAD23A或RAD23B mRNA的反义寡核苷酸（ASO）。在TAR4/4新生小鼠中脑室内注射靶向RAD23A的ASO，能有效降低其在大脑皮层和脊髓中的mRNA和蛋白水平（约80%敲低），且不影响RAD23B的表达。这种干预带来了显著的效果：与接受无关序列ASO（SCR）的对照小鼠（TAR4/4;RAD23ASCR）相比，敲低RAD23A的TAR4/4小鼠（TAR4/4;RAD23AKD）寿命延长了约9天（约50%的增长）。同时，小鼠的运动功能异常，如步态障碍、震颤、驼背（kyphosis）和后肢抓握现象，其出现和发展速度也明显减缓。为了验证这一发现，研究人员还通过基因工程手段获得了RAD23A基因敲除（RAD23A-/-）和杂合（RAD23A+/-）小鼠。有趣的是，与TAR4/4;RAD23AKD类似，TAR4/4;RAD23A+/-小鼠（RAD23A蛋白减少约40%）也表现出寿命延长。然而，令人意外的是，完全缺失RAD23A（TAR4/4;RAD23A-/-）并未能进一步延长寿命，这可能暗示了发育过程中的代偿机制或仅需低水平RAD23A即可驱动病理。与此形成鲜明对比的是，敲低RAD23B不仅没有益处，反而会缩短TAR4/4小鼠的寿命，且呈剂量依赖性，这表明RAD23A和RAD23B在TDP-43蛋白病变中可能具有相反或不同的功能。
RAD23A敲低减轻TAR4/4小鼠的组织病理学异常
TAR4/4小鼠会表现出典型的神经退行性病理特征。组织学分析发现，与野生型小鼠相比，TAR4/4;RAD23ASCR小鼠的运动皮层中神经元（NeuN阳性）数量减少，而活化的星形胶质细胞（GFAP阳性）和小胶质细胞（Iba1阳性）数量增加，表明存在神经炎症和神经退行性变。然而，在TAR4/4;RAD23AKD小鼠中，这些病理变化得到了显著缓解：神经元丢失减少，胶质细胞活化程度降低。此外，TAR4/4小鼠大脑皮层中出现的凋亡标志物——裂解的Caspase 3的水平，在RAD23A敲低后也下降了约50%。这些结果从组织层面证实了降低RAD23A对神经元的保护作用。
人TDP-43的转录组学效应是RAD23A依赖性的
TDP-43的正常功能与RNA代谢密切相关。为了探究RAD23A敲低带来的益处是否与纠正TDP-43病理引起的转录组紊乱有关，研究人员对小鼠大脑进行了RNA测序（RNA-Seq）分析。比较TAR4/4;RAD23ASCR与野生型小鼠，发现了大量差异表达基因，代表了“疾病基因”特征。而比较TAR4/4;RAD23AKD与TAR4/4;RAD23ASCR，则发现了另一组“治疗基因”，其中许多基因的表达变化在RAD23A敲低后发生了逆转。主成分分析和聚类热图均显示，RAD23A敲低使TAR4/4小鼠的转录组特征向野生型小鼠回调。基因本体（GO）分析进一步揭示，这些被逆转的基因功能富集在神经功能、神经发育、线粒体功能、线粒体生物发生以及聚集性自噬（aggrephagy）等关键通路。这表明RAD23A敲低能够显著削弱hTDP-43对转录组的毒性影响。
TDP-43的不溶性和聚集是RAD23A依赖性的
TDP-43的毒性与其剂量和聚集状态密切相关。研究人员发现，RAD23A敲低不仅减少了TAR4/4小鼠大脑中总TDP-43（人源加鼠源）的水平，更重要的是，它显著降低了TDP-43在细胞质与细胞核中的比例，表明更多的TDP-43被保留在核内行使正常功能。生化分析进一步显示，RAD23A敲低使Sarkosyl可溶性和不可溶性组分中的人源TDP-43以及其有毒的25 kDa C末端片段均大幅减少。免疫组织化学染色结果与此一致：RAD23A敲低后，大脑皮层神经元细胞核内和细胞质中的TDP-43阳性以及磷酸化TDP-43（Ser409/410）阳性聚集体数量显著减少。这些发现表明，降低RAD23A能有效减少毒性TDP-43形式的积累。
TDP-43对蛋白质稳态的破坏是RAD23A依赖性的
TDP-43病理灶通常被泛素化标记。研究发现，TAR4/4小鼠大脑中总泛素水平显著升高，而RAD23A敲低后，可溶性和不可溶性组分中的泛素水平均下降，提示蛋白酶体功能可能得到改善。为了验证这一点，研究人员设计实验，发现表达突变型TDP-43（Q331K）的细胞裂解物中，Sarkosyl不可溶性组分能显著抑制纯化蛋白酶体的酶活性。更重要的是，在TAR4/4小鼠脑裂解物中，针对三种不同蛋白酶体酶活底物（LLVY-AMC, RPPGFSAFK, KKVAPYPME）的检测均显示蛋白酶体功能受损，而RAD23A敲低则能部分恢复其活性。机制上，研究发现TAR4/4小鼠脑中，蛋白酶体的多个亚基（如PSMA3, PSMC2, PSMC5）更多地被“扣押”在Sarkosyl不可溶性组分中，而这一现象在RAD23A敲低后得到缓解。同时，响应蛋白酶体功能受损而表达上调的核因子Nrf1（NFE2L1）的水平，在RAD23A敲低后也显著下降。这些结果提示，RAD23A可能促进了蛋白酶体组分被招募到TDP-43引发的不可溶性聚集体中，从而导致其功能失活。
RAD23A调控TDP-43引发的不溶性蛋白质组的组成
既然RAD23A并不直接与TDP-43发生强烈的物理相互作用，那么它是如何发挥上述作用的呢？研究人员推测，RAD23A敲低可能改变了由TDP-43引发的不溶性蛋白质组的质量而非简单数量。通过稳定同位素标记（SILAM）结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的定量蛋白质组学分析，他们比较了TAR4/4;RAD23AKD与TAR4/4;RAD23ASCR小鼠大脑不溶性蛋白质组的差异。结果显示，两种处理下的小鼠不溶性蛋白质组存在显著差异。在SCR ASO处理的小鼠中，细胞骨架和马达蛋白等网络在不可溶性组分中富集程度更高；而在RAD23A敲低的小鼠中，核糖体蛋白等则在不可溶性组分中更富集。这表明RAD23A确实扮演着“雕塑家”的角色，决定了哪些蛋白质会被卷入TDP-43病理背景下形成的不可溶性聚集体中，这种组成的改变可能对细胞功能的破坏程度产生关键影响。
结论与意义
本研究有力地证明，在TDP-43蛋白病变的小鼠模型中，降低RAD23A的丰度能够有效缓解其神经毒性。这种保护作用体现在延长寿命、改善行为、减轻病理损伤、纠正转录组紊乱、减少毒性TDP-43形式、增强蛋白酶体功能以及重塑不溶性蛋白质组等多个层面。研究创新性地揭示了RAD23A通过调控蛋白酶体功能和不溶性蛋白质组组成，在TDP-43蛋白病变中发挥关键作用，这不同于其经典的底物穿梭功能。该研究不仅深化了对神经退行性疾病蛋白质稳态失衡机制的理解，更重要的是，将RAD23A确立为一个潜在的治疗靶点。鉴于TDP-43病理在多种神经退行性疾病中的广泛存在，针对RAD23A的开发（如ASO药物）可能为ALS、FTD等疾病提供新的治疗策略。未来的研究需要进一步阐明RAD23A精确的分子作用机制，并探索其在人类疾病中的转化前景。
