《Research》：ZFP36 Protects against Abdominal Aortic Aneurysm Formation by Regulating Vascular Smooth Muscle Phenotypic Switch
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本研究针对缺乏有效药物治疗的腹主动脉瘤(AAA)疾病，发现RNA结合蛋白ZFP36在AAA组织中表达下调。研究人员通过构建血管平滑肌细胞(VSMC)特异性Zfp36基因敲除小鼠模型，证实ZFP36通过靶向GBP2 mRNA降解，调控YAP1/TEAD1信号通路，从而维持VSMC收缩表型，抑制AAA发展。更重要的是，研究发现低剂量地塞米松(Dex)可通过促进糖皮质激素受体(NR3C1)核转位激活ZFP36转录，为AAA药物治疗提供了新策略。
腹主动脉瘤（Abdominal Aortic Aneurysm, AAA）是一种危及生命的主动脉疾病，其特征是腹主动脉局部的弱化和扩张。大多数AAA患者早期没有明显症状，但一旦发生破裂，死亡率超过80%。目前，AAA已成为全球范围内致残和致死的主要原因之一，且发病率仍在持续上升。临床上对AAA的干预主要局限于手术治疗，包括开放手术和腔内修复术，而有效的药物治疗策略仍然缺乏，这凸显了寻找AAA治疗新靶点的紧迫性。
在血管壁中，血管平滑肌细胞（Vascular Smooth Muscle Cells, VSMCs）是中层膜的主要成分，在维持血管稳态中起着至关重要的作用。健康的血管壁中，VSMCs呈现收缩表型，高表达α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、平滑肌22α（SM22α）和肌球蛋白重链11（MYH11）等收缩蛋白。当血管受损时，VSMCs会转变为合成表型，这种细胞能够释放基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinases, MMPs）和促炎细胞因子，导致炎症细胞迁移和细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）降解。VSMCs的表型转换是AAA等多种主动脉疾病发病机制的基础，因此，理解其调控机制对于开发AAA治疗策略至关重要。
RNA结合蛋白（RNA-Binding Proteins, RBPs）是基因表达的关键效应因子，能够操纵RNA的各个方面，包括转录、剪接、修饰、细胞内运输、翻译和衰变。研究表明，RBPs的功能失常会引发多种疾病，包括AAA，因此它们可能成为治疗策略开发的有希望的靶点。锌指蛋白36（Zinc Finger Protein 36, ZFP36）是RBPs家族中的一员，属于富含AU元件的RNA结合蛋白（AUBP）家族，它倾向于结合3‘-非翻译区（3’-Untranslated Regions, 3‘-UTRs）内的AU富集元件，促进mRNA的去腺苷化和降解。ZFP36因其在许多自身免疫性疾病中的卓越抗炎作用而受到广泛关注。其在抑制泡沫细胞形成和动脉粥样硬化中的保护作用也已被报道。然而，ZFP36与VSMCs表型转换之间的关联及其在AAA形成中的参与仍不清楚。
为了回答上述问题，研究人员开展了一项系统的研究，并最终将成果发表在《Research》期刊上。研究发现，ZFP36在人和小鼠的AAA组织中表达显著下调，特别是在VSMCs中。通过构建VSMC特异性Zfp36基因敲除（Zfp36△SMC）小鼠，研究人员证实ZFP36缺失会加剧血管紧张素II（Angiotensin II, AngII）诱导的AAA形成，表现为主动脉最大直径增加、发病率升高。相反，在VSMCs中特异性过表达Zfp36则能抑制AAA的进展。机制上，通过批量测序分析，研究人员发现鸟苷酸结合蛋白2（Guanylate Binding Protein 2, GBP2）是ZFP36的直接靶基因。ZFP36通过结合Gbp2 mRNA的3‘-UTR促进其降解，从而调控Yes相关蛋白1（Yes-associated protein 1, YAP1）/TEA域转录因子1（TEA domain transcription factor 1, TEAD1）信号通路。具体而言，ZFP36缺失导致GBP2上调，GBP2与TEAD1相互作用并通过自噬-溶酶体途径促进TEAD1降解，致使YAP1与TEAD1解离，转而与Krüppel样因子4（Krüppel-like factor 4, KLF4）结合形成YAP1/KLF4复合物，最终驱动VSMCs向合成表型转换，促进AAA发展。
此外，研究人员发现临床常用药物地塞米松（Dexamethasone, Dex）能够促进糖皮质激素受体（Glucocorticoid Receptor, NR3C1，也称核受体亚家族3组C成员1）核转位，进而转录激活Zfp36的表达。体内实验表明，低剂量（10 μg/kg/天）Dex腹腔注射能通过ZFP36依赖的方式有效预防AngII诱导的AAA形成，改善了主动脉重构。这项研究揭示了ZFP36/GBP2/YAP1/TEAD1信号轴在调控VSMCs表型转换和AAA形成中的关键作用，并为Dex作为AAA潜在治疗药物提供了新的理论依据和实验证据。
为开展本研究，研究人员运用了多种关键技术方法。在生物信息学分析方面，利用公共AAA微阵列数据集（GSE47472）和RBP数据库筛选候选RBPs。在动物模型构建上，成功培育了VSMC特异性Zfp36基因敲除（Zfp36△SMC）小鼠，并建立了AngII灌注和猪胰弹性蛋白酶（Porcine Pancreatic Elastase, PPE）诱导的两种经典AAA小鼠模型。在分子机制探索中，综合运用了实时定量PCR（RT-qPCR）、蛋白质印迹（Western Blot, WB）、免疫荧光（Immunofluorescence, IF）、RNA免疫共沉淀（RNA Immunoprecipitation, RIP）、双荧光素酶报告基因检测、染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation, ChIP）、Co-免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）以及批量RNA测序（Bulk RNA Sequencing）等技术。在细胞功能研究中，采用了原代小鼠主动脉VSMCs培养、小干扰RNA（siRNA）和腺病毒介导的基因敲降与过表达等手段。临床样本来源于山东大学齐鲁医院经手术获取的人AAA组织及健康供体主动脉组织（经伦理委员会批准）。
ZFP36在AAA进程中表达下调
研究人员通过整合分析公共数据库GSE47472和人类RBP数据集，筛选出在AAA中差异表达的RBPs，发现Zfp36是下调最显著的候选基因之一。在人和小鼠的AAA组织以及AngII刺激的VSMCs中，通过RT-qPCR、WB和IF等多种方法均证实ZFP36的表达显著降低，提示其可能参与VSMCs功能障碍和AAA形成。
VSMCs中的ZFP36阻止AAA进展
为了验证ZFP36的功能，研究团队构建了VSMC特异性Zfp36敲除小鼠（Zfp36△SMC）及其同窝对照小鼠（Zfp36flox/flox）。在AngII诱导的AAA模型中，Zfp36△SMC小鼠表现出更高的AAA发病率和更大的主动脉最大直径。同样，在PPE诱导的AAA模型中，Zfp36缺失也加剧了动脉瘤病变。相反，通过AAV2载体在VSMCs中过表达Zfp36则能抑制AAA的形成。这些结果强有力地表明，VSMCs来源的Zfp36是抵御AAA发病的内源性保护因子。
VSMC特异性Zfp36缺失加剧AngII诱导的主动脉重构
ECM降解、炎症和VSMCs凋亡是AAA发病的基础。组织染色（Masson和EVG染色）显示，Zfp36△SMC小鼠主动脉中弹性蛋白降解和胶原沉积显著增加。WB和明胶酶谱法检测发现，Zfp36缺失增强了AngII诱导的MMP2上调和MMP活性。RT-qPCR结果显示主动脉组织中炎症因子（Il-1β, Il-6, Tnf, Ccl-2）表达升高。此外，WB和TUNEL染色表明Zfp36缺失促进了VSMCs凋亡。这些数据证明ZFP36通过抑制ECM降解、炎症和VSMCs凋亡来改善AngII诱导的主动脉重构。
ZFP36调控VSMCs表型转换
对Zfp36△SMC和Zfp36flox/flox小鼠主动脉组织的批量测序分析发现，与VSMCs表型转换、炎症、凋亡和ECM相关的基因表达发生显著改变。在VSMCs中敲低Zfp36加剧了AngII诱导的收缩表型蛋白（MYH11, α-SMA, SM22α）下调以及合成表型蛋白（TSP-1, KLF4, OPN）的上调。而过表达Zfp36则得到相反的结果，抑制了AngII诱导的VSMCs表型转换。这表明ZFP36是VSMCs表型转换的关键调控因子。
鉴定GBP2为AAA进程中ZFP36的靶点
对测序数据的基因本体（Gene Ontology, GO）分析显示免疫炎症通路显著富集。其中，GBP家族多个成员（Gbp2至Gbp10）在Zfp36△SMC小鼠主动脉中显著上调。后续验证表明，Gbp2在AngII刺激的主动脉组织和VSMCs中上调最显著，且ZFP36缺失进一步增强了这种上调。RIP、mRNA稳定性实验和双荧光素酶报告基因实验证实，ZFP36直接结合Gbp2 mRNA的3‘-UTR并促进其降解。体内挽救实验表明，在Zfp36△SMC小鼠中敲低Gbp2能够显著改善由Zfp36缺失加剧的AAA进展和主动脉重构。因此，GBP2被确定为ZFP36在AAA进程中的直接下游靶点。
ZFP36以GBP2/YAP1/TEAD1依赖的方式抑制VSMCs表型转换
在VSMCs中同时敲低Zfp36和Gbp2，发现Gbp2敲低可以逆转由Zfp36敲低引起的表型转换相关蛋白表达变化，证明ZFP36通过调控GBP2来操纵VSMCs表型转换。Co-IP实验证实GBP2与TEAD1存在相互作用。过表达Gbp2导致TEAD1蛋白水平下调，但不影响其mRNA水平，且自噬抑制剂氯喹（Chloroquine, CQ）可以恢复TEAD1表达，提示GBP2通过自噬-溶酶体途径促进TEAD1降解。进一步实验表明，Zfp36敲低减少了YAP1与TEAD1的结合，同时增加了YAP1与KLF4的结合；而Gbp2敲低则能逆转这些效应。ChIP实验证实Zfp36敲低减少了YAP1在Tagln启动子区TEAD1结合位点的富集，增加了其在KLF4结合位点的富集，Gbp2敲低同样逆转了这些变化。这些结果阐明了ZFP36通过GBP2/YAP1/TEAD1信号轴调控VSMCs表型转换的分子机制：ZFP36缺失导致GBP2积累，进而降解TEAD1，促使YAP1与KLF4形成复合物，驱动合成表型基因表达。
Dex通过促进糖皮质激素受体核转位转录激活ZFP36
研究发现Dex处理能显著上调VSMCs中ZFP36的表达，并伴随收缩表型蛋白上调以及GBP2下调。机制上，Dex处理促进了NR3C1的核转位。通过ChIP和双荧光素酶报告基因实验，证实NR3C1主要结合于Zfp36启动子区的糖皮质激素反应元件（GRE），并激活其转录。敲低Nr3c1或Zfp36均能完全阻断Dex对VSMCs表型的保护作用。这表明Dex通过促进NR3C1核转位转录激活Zfp36，从而维持VSMCs的收缩表型。
低剂量Dex给药以ZFP36依赖的方式预防AAA形成
体内剂量探索实验发现，低剂量（10 μg/kg/天）Dex腹腔注射能显著上调主动脉组织中的ZFP36表达，而中高剂量效果较弱。在AAA模型中，低剂量Dex治疗能显著降低Zfp36flox/flox小鼠的AAA死亡率、发病率和主动脉最大直径，并改善主动脉重构（减少弹性蛋白断裂和胶原沉积）。然而，在VSMC特异性Zfp36敲除（Zfp36△SMC）小鼠中，Dex的保护作用完全消失。这证明低剂量Dex是通过上调ZFP36来发挥其预防AAA形成的作用。
本研究结论与讨论部分归纳指出，研究揭示了ZFP36在AAA形成中的保护作用及其通过靶向GBP2调控YAP1/TEAD1信号通路进而影响VSMCs表型转换的新机制。更重要的是，研究发现临床常用药Dex能够通过激活NR3C1-ZFP36轴来发挥治疗潜力。这不仅深化了对AAA发病机制的理解，特别是VSMCs表型转换的精细调控网络，也为AAA的药物治疗提供了新的候选策略——即低剂量Dex的潜在应用。研究首次将ZFP36的功能与VSMCs表型稳定性联系起来，并将炎症相关因子GBP2确立为VSMCs功能失调的关键调节因子。关于YAP1/TEAD1复合物在VSMCs中作用的争议，本研究提供了新的视角，即其功能可能取决于相互作用的伙伴（TEAD1或KLF4）。虽然低剂量Dex在临床转化前仍需解决最佳剂量、给药途径和潜在副作用等问题，但本研究为开发针对小AAA或作为手术辅助疗法的药物治疗方案奠定了坚实的理论基础。
