《Research》：Histone Lactylation Couples FSH-Driven Lactate Metabolism to Mitochondrial Biogenesis by Enhancing HDAC4-Mediated Deacetylation of PGC-1α in Granulosa Cells
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本研究揭示了卵泡刺激素（FSH）通过激活糖酵解产生乳酸，进而诱导组蛋白H4第5位赖氨酸发生乳酸化修饰（H4K5la）。该表观遗传标记直接上调HDAC4的表达，HDAC4随后对PGC-1α进行去乙酰化修饰，从而促进其与NRF1/2结合，共同驱动线粒体生物发生关键基因（如TFAM、TFB1M、TFB2M）的转录，最终满足卵泡发育的能量需求。这项发表于《Research》的工作阐明了代谢物如何通过表观遗传机制精确调控细胞器生物发生的新通路，为理解生殖生理及代谢相关疾病提供了新视角。
在卵巢中，卵泡的正常发育是女性生殖健康的基石，而这一过程高度依赖于卵泡颗粒细胞的精密协调。颗粒细胞不仅为发育中的卵母细胞提供结构支持和营养，还负责产生必需的激素。为了支撑这些能量密集型活动，如类固醇合成、细胞增殖和卵母细胞成熟支持，颗粒细胞必须动态地重编程其代谢途径和线粒体活性。其中，卵泡刺激素作为主导的内分泌信号，驱动着卵泡的生长和颗粒细胞的分化。除了激活经典的FSH受体-cAMP/PKA信号通路外，FSH还作为一个强大的代谢调节因子，能显著增加颗粒细胞的葡萄糖摄取和糖酵解通量。然而，一个长期悬而未决的关键科学问题是：FSH激发的糖酵解活性是如何与线粒体的生物发生过程相偶联，以满足卵泡发育骤然增加的能量需求的？传统的观点认为，糖酵解的终产物乳酸 merely 作为线粒体的代谢底物。但近年来的研究发现，乳酸也是一种具有信号功能的活性代谢物，甚至可以作为组蛋白乳酸化修饰的底物，直接将细胞代谢状态与染色质结构和基因调控联系起来。这促使研究人员思考，是否存在一条由乳酸介导的表观遗传通路，在FSH作用下，将糖酵解与线粒体生物发生精密地耦合起来。
为了回答这一问题，研究人员展开了一项深入的研究。他们发现，FSH处理能够有效促进小鼠体内颗粒细胞的线粒体生物发生，具体表现为线粒体DNA拷贝数、线粒体标志蛋白TOM20的表达量以及ATP水平的显著提升。值得注意的是，FSH在激活糖酵解的同时，确实导致了细胞内乳酸水平的升高。更重要的是，研究人员首次观察到，FSH诱导产生了显著的组蛋白乳酸化修饰，特别是组蛋白H4第5位赖氨酸的乳酸化。进一步的机制探索揭示，乳酸化的“书写”酶P300/CBP负责催化H4K5la的形成。而H4K5la这一表观遗传标记，能够直接增强组蛋白去乙酰化酶4的表达。HDAC4随后发挥其酶活功能，对过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1-α的329和330位赖氨酸残基进行去乙酰化。去乙酰化后的PGC-1α则能更有效地与核呼吸因子1和2结合，进而启动包括TFAM、TFB1M、TFB2M在内的关键线粒体生物发生相关基因的转录，最终驱动线粒体的生成。通过药理学抑制乳酸生成、干扰LDHA/B表达或直接抑制P300/CBP活性来阻断这条H4K5la/HDAC4/PGC-1α轴，均会显著削弱FSH诱导的线粒体生物发生。在体实验也证实，破坏该通路会损害颗粒细胞的增殖、雌激素E2的产生以及卵泡的正常发育。这项研究成功地描绘了一条全新的代谢-表观遗传调控通路：FSH-糖酵解-乳酸-H4K5la-HDAC4-PGC-1α去乙酰化-线粒体生物发生。该通路阐明了乳酸如何作为一种表观遗传信号，将代谢状态转化为基因表达指令，从而协调细胞器生物发生以适应生理需求的新机制，为理解能量代谢如何通过表观遗传调控生殖细胞发育提供了创新性视角。
为开展此项研究，作者运用了多种关键技术方法。在体实验使用小鼠模型进行FSH干预。细胞模型主要采用小鼠原代颗粒细胞和人颗粒细胞样肿瘤细胞系。关键实验技术包括：通过细胞外酸化率和耗氧率分析代谢状态；利用蛋白质印迹、免疫组织化学/荧光、染色质免疫共沉淀等技术检测蛋白表达、修饰及定位；通过质谱分析鉴定组蛋白乳酸化位点；采用CUT&Tag和RNA测序进行全基因组范围内的表观遗传标记和基因表达谱分析；使用线粒体膜电位探针、MitoTracker染色、电镜观察评估线粒体功能与形态；并通过线粒体DNA拷贝数定量、ATP检测等功能学实验验证表型。
FSH促进颗粒细胞线粒体生物发生并与H4K5la升高相关
研究人员首先在体验证了FSH对颗粒细胞线粒体生物发生的促进作用。通过腹腔注射FSH的小鼠模型发现，FSH处理显著增加了颗粒细胞中线粒体DNA编码基因MT-CO2和D-Loop区域的拷贝数，提升了线粒体膜蛋白TOM20的水平。透射电镜观察进一步证实FSH增加了线粒体数量并改善了其超微结构。同时，与线粒体融合相关的蛋白表达上调，而裂变相关蛋白活性受到抑制，细胞ATP水平也显著升高。这些结果确认了FSH在生理条件下有效启动了线粒体生物发生。紧接着，研究发现FSH刺激导致颗粒细胞内葡萄糖转运蛋白表达上升和乳酸水平升高。重要的是，免疫组化和蛋白质印迹分析显示，FSH处理引起了卵巢组织特别是颗粒细胞中整体蛋白乳酸化和组蛋白H4K5la的显著增加。质谱分析鉴定出H4K5是具体的乳酸化修饰位点。这些发现提示，乳酸来源的H4K5la可能是FSH诱导颗粒细胞线粒体生物发生的潜在表观遗传介质。
抑制乳酸生产/H4K5la削弱FSH诱导的颗粒细胞线粒体生物发生
为了确认FSH是否通过乳酸/组蛋白乳酸化途径促进线粒体生物发生，研究人员在KGN细胞中证实FSH增加了糖酵解速率。随后，他们采用糖酵解抑制剂或siRNA敲低LDHA/B的方式降低细胞内乳酸水平。结果显示，这两种干预均有效降低了FSH刺激下颗粒细胞中的整体蛋白乳酸化和H4K5la水平。相应地，组蛋白乳酸化的减少显著损害了FSH诱导的线粒体生物发生，具体表现为线粒体DNA拷贝数、TOM20蛋白丰度以及MitoTracker Green荧光的下降。更重要的是，在LDHA/B敲低的细胞中补充外源性乳酸，能够恢复H4K5la水平和线粒体生物发生。此外，抑制乳酸生产还削弱了FSH提升的耗氧率和ATP产量，而乳酸补充则可以挽救这些效应。FSH处理还显著增强了线粒体膜电位，此效应可被乳酸生产抑制剂所削弱，并被乳酸补充所恢复。对线粒体自噬标记物的分析表明，FSH并非通过抑制线粒体自噬来增加线粒体含量，反而是激活了线粒体自噬流。这些结果共同表明，FSH通过乳酸/组蛋白乳酸化通路促进颗粒细胞的线粒体生物发生。
FSH通过P300/CBP催化的H4K5la促进线粒体生物发生
为了寻找催化H4K5la的酶，研究人员通过siRNA筛选，发现敲低P300及其同源蛋白CBP能降低H4K5la水平，从而将P300/CBP鉴定为与此乳酸化标记相关的关键乳酸转移酶。使用特异性P300/CBP抑制剂C646处理，有效抑制了FSH处理的颗粒细胞中的整体乳酸化和H4K5la。接下来，抑制P300/CBP活性 abolished 了FSH诱导的线粒体DNA含量增加、TOM20表达上调、线粒体质量增加、耗氧率提升以及线粒体膜电位增强等一系列线粒体生物发生指标。为了排除C646可能的脱靶效应，研究人员单独敲低了P300和CBP，同样观察到了H4K5la水平的降低以及FSH诱导的线粒体生物发生的减弱。这些数据共同证明，P300/CBP介导的H4K5la有助于FSH驱动的颗粒细胞线粒体生物发生。
H4K5la调控的下游靶基因鉴定
为了评估组蛋白乳酸化对FSH激活的颗粒细胞中基因表达的影响，研究人员使用H4K5la特异性抗体进行了CUT&Tag分析。结果显示，H4K5la峰值主要富集在启动子区域。基因本体论分析表明，H4K5la靶基因在代谢调控中显著富集。通过整合CUT&Tag数据和LDHA/B敲低后的RNA测序数据，研究人员筛选出71个转录受H4K5la调控的基因。进一步与FSH上调的基因进行交叉比对，最终确定了22个受FSH诱导且在被LDHA/LDHB敲低后显著下调的H4K5la靶基因。其中，HDAC4的启动子区域显示出强烈的H4K5la富集。后续实验证实，抑制乳酸生产或敲低LDHA/B会降低FSH刺激的颗粒细胞中HDAC4的mRNA和蛋白表达水平。染色质免疫共沉淀实验进一步验证了FSH刺激下HDAC4启动子区域的H4K5la富集，且此富集可被乳酸化抑制剂所减弱。这些结果确立了FSH诱导的H4K5la能驱动颗粒细胞中HDAC4的转录上调。
HDAC4通过调节PGC-1α活性促进FSH诱导的线粒体生物发生
研究人员接下来探讨了HDAC4在FSH处理的颗粒细胞中的功能作用。使用HDAC4的特异性抑制剂LMK-235处理或siRNA敲低HDAC4，均显著削弱了FSH诱导的线粒体生物发生，表现为线粒体DNA拷贝数、TOM20蛋白水平以及MitoTracker Green荧光的降低。HDAC4的敲低还抑制了FSH刺激的耗氧率和线粒体膜电位的提升。这些结果 firmly 确立了HDAC4是FSH刺激下颗粒细胞线粒体生物发生的关键调节因子。
HDAC4通过位点特异性去乙酰化调节PGC-1α活性来调控线粒体生物发生
已知PGC-1α是线粒体生物发生的主要调控因子，其活性受到翻译后修饰的精细调控。此前研究表明，HDAC4能直接作用于PGC-1α，并对其329和330位赖氨酸残基进行去乙酰化。本研究发现，FSH刺激能显著降低PGC-1α的乙酰化水平，而抑制P300/CBP或敲低HDAC4则会逆转这一效应。通过构建PGC-1α的位点特异性突变体，研究人员证实K329/K330是PGC-1α主要的乙酰化位点。功能实验表明，模拟去乙酰化的PGC-1α突变体能增强线粒体生物发生，而模拟乙酰化的突变体则削弱该过程。这些发现说明，FSH通过降低PGC-1α的乙酰化水平，从而促进其核定位及激活功能，进而增强线粒体生物发生。
PGC-1α去乙酰化通过招募NRF1/2驱动线粒体生物发生
PGC-1α作为转录共激活因子，需要进入细胞核并与NRF1/2等转录因子协作才能发挥功能。研究发现，FSH刺激显著增强了PGC-1α与NRF1/2的相互作用，而破坏乳酸依赖的H4K5la则会消除此效应。同样，抑制P300/CBP或敲低HDAC4也会减弱FSH诱导的PGC-1α–NRF1/2复合物形成。表达不同乙酰化状态的PGC-1α突变体证实，去乙酰化能促进PGC-1α与NRF1/2的结合及其在靶基因启动子上的富集，从而驱动线粒体生物发生相关基因的转录。
抑制H4K5la/HDAC4/PGC-1α通路损害体内FSH诱导的线粒体生物发生和卵泡发育
为了评估H4K5la/HDAC4/PGC-1α通路的生理相关性，研究人员在FSH处理的小鼠中使用了针对该通路关键组分的抑制剂。抑制P300/CBP的乳酸化活性、HDAC4或PGC-1α的功能，均能削弱FSH诱导的线粒体生物发生，表现为线粒体基因表达、mtDNA拷贝数和TOM20蛋白水平的下降。同时，这些干预还导致了雌激素E2产量降低、颗粒细胞增殖减少、卵巢体积和重量变小、卵泡发育停滞以及有腔卵泡数量减少。这些体内实验数据有力地证明，H4K5la/HDAC4/PGC-1α轴对于FSH介导的卵泡正常发育至关重要。
研究结论与意义
本研究系统地阐明了一条全新的代谢-表观遗传调控轴：乳酸–H4K5la–HDAC4轴，该轴将FSH刺激的糖酵解与线粒体生物发生耦合起来。机制上，FSH诱导的组蛋白H4K5la修饰激活了HDAC4的转录，导致PGC-1α发生去乙酰化，进而增强其与NRF1/2的相互作用，最终促进线粒体生物发生以满足卵泡发育的能量需求。这项工作重新定义了乳酸的双重功能：它既是支持线粒体呼吸的代谢燃料，又是作为表观遗传修饰底物的信号分子。通过H4K5la将糖酵解通量转化为染色质修饰信号，组蛋白乳酸化作为一种动态的调控枢纽，使线粒体能力能够与激素信号同步。这项研究增进了我们对生殖能量代谢的理解，并为治疗生殖障碍中的代谢功能障碍提供了潜在的干预靶点。
