《Applied and Environmental Microbiology》：Warfare among rice sheath pathogens: Rhizoctonia solani AG 1-IA neutralizes Pseudomonas fuscovaginae cyclic lipopeptides
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本综述揭示了水稻两大病原体——鞘褐腐病菌（Pseudomonas fuscovaginae）与立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）AG 1-IA间的温度依赖性拮抗作用。研究发现，在低温（18°C）下，细菌高产具有抗真菌和植物毒性的环脂肽（CLiPs），抑制真菌生长；而在高温（28°C）下，真菌分泌特异性酯酶和蛋白酶，分别水解丁香毒素（syringotoxin）的酯键和裂解褐孢肽（fuscopeptin）的甘氨酸-丙氨酸肽键，使CLiPs失活，从而获得竞争优势。这种靶向降解机制解释了二者在田间难以共生的现象，为理解病原微生物互作及生态位竞争提供了新视角。
摘要
本研究探讨了两种水稻鞘部病原体——引起鞘褐腐病的细菌Pseudomonas fuscovaginae和引起纹枯病的真菌Rhizoctonia solaniAG 1-IA之间相互作用的化学基础。研究重点关注细菌产生的环脂肽（CLiPs）丁香毒素和褐孢肽在此互作中的命运。超高效液相色谱-串联质谱分析表明，R. solaniAG 1-IA可能分泌两种不同的酶：一种酯酶水解丁香毒素中的酯键，产生线性衍生物；另一种蛋白酶切割褐孢肽肽骨架中的甘氨酸-丙氨酸键。降解产物丧失了抗真菌和植物毒性活性，从而抵消了P. fuscovaginae的竞争优势。这些酶的降解活性在28°C时增强。本研究首次证明R. solaniAG 1-IA通过靶向酶降解主动中和P. fuscovaginae的抗真菌和植物毒性活性。
引言
Rhizoctonia solani是一种土传真菌病原体，根据遗传相关性、菌丝融合行为、培养形态、寄主范围和致病性等因素，被划分为14个融合群（AG 1-13和BI）。其中，R. solaniAG 1-IA是水稻纹枯病的主要致病菌，在25°C至30°C的温度范围内生长旺盛。另一种重要的水稻病原体是Pseudomonas fuscovaginaeUPB0736，它属于Pseudomonas fluorescens群中的Pseudomonas asplenii亚群，引起细菌性鞘褐腐病，尤其在凉爽的高海拔地区（通常温度在18°C至23°C或更低）发病严重。
Pseudomonas物种以其合成环脂肽（CLiPs）的能力而闻名。CLiPs是具有多种生物功能的两亲性特化代谢物。具体来说，P. fuscovaginaeUPB0736产生三种特征明确的CLiPs：丁香毒素（属于Mycin家族，具有抗真菌活性，能在生物膜上形成孔道）、褐孢肽（属于Peptin家族，具有植物毒性，能抑制植物H+-ATPase并使膜透化）以及asplenin（不显示抗真菌或植物毒性活性，但在细菌运动性中起关键作用）。
值得注意的是，P. fuscovaginaeUPB0736主要通过丁香毒素的抗真菌作用抑制R. solani和其他真菌病原体的生长。先前的研究表明，P. fuscovaginaeUPB0736产生CLiPs的最适温度是18°C。此外，R. solaniAG 1-IA在18°C时对丁香毒素和褐孢肽更敏感，而在28°C时敏感性降低。本研究假设温度依赖性拮抗作用是导致这两种病原体在田间条件下未见同时发生的原因：在18°C时，升高的CLiP产量增强了细菌毒力并抑制真菌生长；而在28°C时，减少的CLiP产量加上真菌的酶降解使竞争平衡向有利于R. solaniAG 1-IA的方向转变。
材料与方法
菌株与培养条件
研究中使用的细菌（P. fuscovaginae野生型及其多种基因缺失突变体）和真菌（多种R. solaniAG型菌株）列于表1。细菌在King’s B液体培养基或马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）中于18°C培养。真菌在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）上于28°C培养，液体培养在PDB中于18°C或28°C进行。
代谢物提取与化学分析
使用Oasis HLB固相萃取柱从细菌培养上清液中提取CLiPs，并通过超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）进行分析。通过化学水解（使用NaOH，pH ~11）获得CLiPs的线性化标准品用于比对。
降解活性评估
通过将R. solani的培养上清液（SN）与P. fuscovaginae的CLiP粗提物或上清液混合，并在不同时间点（如1小时或2天后）通过UPLC-MS/MS检测CLiPs的浓度变化，来评估其降解活性。通过热灭活（100°C，10分钟）处理真菌上清液以验证酶的作用。同时，在PDA平板上通过测定真菌菌丝生长抑制率来评估CLiP降解后的生物活性丧失情况。此外，还在菊苣叶片上进行了植物毒性试验。
不同AG菌株的CLiP降解潜力
测试了来自越南的不同AG的R. solani分离株，将其上清液与细菌上清液混合，分析其对丁香毒素和褐孢肽的降解能力。
结果
R. solaniAG 1-IA降解丁香毒素和褐孢肽
共培养实验表明，R. solaniAG 1-IA的上清液或菌块能显著降低P. fuscovaginae产生的丁香毒素水平。将R. solaniAG 1-IA的过滤除菌上清液与P. fuscovaginae的上清液混合后，仅1小时即可观察到丁香毒素的显著减少，且该降解作用可被热灭活处理所消除，表明是热不稳定的酶在起作用。R. solaniAG 2-2的上清液则无此降解能力。
质谱分析发现，在与AG 1-IA上清液孵育的混合物中，出现了质量增加18 Da（对应于双电荷状态下+9 Da）的离子峰，这与丁香毒素环状结构内酯环的酯键水解开环形成的线性化产物一致。化学水解（NaOH处理）产生的标准品与此降解产物具有相同的保留时间和质谱特征，支持了酯键水解的机制。
对于褐孢肽，R. solaniAG 1-IA的上清液处理导致其抗真菌活性丧失，并产生了新的色谱峰。质谱分析表明，这可能是由一种蛋白酶切割褐孢肽A和B的甘氨酸-丙氨酸肽键所致，产生了相应的降解片段。化学水解实验排除了内酯环开裂的可能性。
温度对降解活性的影响
R. solaniAG 1-IA在28°C下培养产生的上清液，其降解丁香毒素和褐孢肽的能力显著强于在18°C下培养的上清液。降解活性随培养时间（2天 vs 5天）延长而增强。相比之下，R. solaniAG 2-2在任何温度下均不降解CLiPs。
植物毒性中和
P. fuscovaginae上清液对菊苣叶片具有植物毒性，主要归因于褐孢肽。当与R. solaniAG 1-IA上清液混合后，植物毒性被完全中和，进一步证实了褐孢肽的降解。
Asplenin不受影响
R. solaniAG 1-IA和AG 2-2的上清液对asplenin均无降解作用，而化学水解可使其开环。
CLiP降解是AG 1-IA分离株的常见特性
测试的所有5个R. solaniAG 1-IA越南分离株均能降解丁香毒素和褐孢肽，且机制相同。其他多核AG分离株（如AG 1-IB, AG 2-2, AG 7）不能降解丁香毒素，部分AG（如AG 1-ID, AG 1-IG, AG 4-HGI）能部分降解褐孢肽。有趣的是，两个测试的双核AG（AG A和AG Fc/V）也能降解这两种CLiPs，但AG A降解褐孢肽的机制可能不同。
讨论
本研究证实了R. solaniAG 1-IA能够通过分泌酶（可能包括酯酶和蛋白酶）降解P. fuscovaginae产生的关键毒力因子——丁香毒素和褐孢肽，从而中和其抗真菌和植物毒性活性。这种降解活性具有温度依赖性，在R. solaniAG 1-IA适宜生长的28°C下更为高效。
P. fuscovaginae在低温（18°C）下CLiP产量高，利于其在凉爽的高海拔地区致病并抑制真菌；而R. solaniAG 1-IA在高温（28°C）下不仅生长更佳，其CLiP降解能力也更强，同时细菌CLiP产量降低，这共同导致竞争优势转向真菌一方。这种温度介导的拮抗作用很可能解释了为何在田间难以观察到这两种病原体同时发生，反映了它们在不同温度条件下对生态位（水稻叶鞘）的竞争策略。
CLiP降解能力在R. solaniAG 1-IA中普遍存在，提示这可能是该重要纹枯病病原体在与细菌竞争者相互作用过程中演化出的一种生态适应策略。对更广泛AG的研究表明，降解CLiPs的能力存在于特定的真菌谱系中，可能涉及不同的酶机制。
这是首次报道真菌降解Pseudomonas产生的CLiPs。此前，CLiPs的酶降解主要见于放线菌。这一发现为了解植物病原微生物之间复杂的化学相互作用和生态位竞争提供了新的视角。未来的研究应致力于鉴定负责降解的特异性酶，并探索这种相互作用在自然环境和农业生态系统中的实际意义。
