沙门氏菌噬菌体抗性突变体的适应性代价及其对噬菌体疗法的启示

《Journal of Virology》：Fitness costs of phage-driven resistance mutations in Salmonella Enteritidis populations

本研究揭示了鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Enteritidis）在噬菌体GRNsp8选择压力下通过btuB基因突变获得完全抗性，但伴随维生素B12摄取缺陷和显著毒力衰减（LD50提升121倍）。该发现为利用细菌“抗性-适应性”权衡策略优化噬菌体疗法提供了关键理论依据。

　　

摘要

在后抗生素时代，噬菌体作为对抗耐药菌感染的重要替代方案备受关注。与抗生素耐药性类似，细菌对噬菌体也会产生抗性，且常伴随适应性代价。本研究以鼠伤寒沙门氏菌WJ48株和广谱噬菌体GRNsp8为模型，通过实验室共进化实验揭示了噬菌体抗性突变体的形成机制及其生物学代价。

噬菌体抗性突变体的筛选与鉴定

通过双层琼脂平板法，从噬菌体裂解斑中分离出三类抗性突变体VP81、VP82和VP84。全基因组测序显示，VP81在糖基转移酶基因发生移码突变，对GRNsp8呈现部分抗性（EOP=0.06）；VP82和VP84均在_btuB基因发生移码突变，导致其编码的维生素B₁₂受体BtuB蛋白截短，完全阻断噬菌体吸附（EOP=0）。生长曲线实验证实三类突变体在噬菌体存在下均能正常增殖。

BtuB作为噬菌体吸附受体的功能验证

通过基因敲除和回补实验进一步验证_btuB基因功能。Δ_btuB突变体完全抵抗噬菌体感染，且噬菌体吸附率接近于零；回补株WJ48-pSTV28-_btuB恢复敏感性和吸附能力（吸附常数_k=3.17×10^-10mL/min）。结构预测显示，突变导致β-桶状结构局部坍塌，影响受体功能。

抗性突变的适应性代价分析

尽管突变体在LB培养基中生长无显著差异，但竞争实验显示Δ_btuB菌株相对适应度（W）在24小时内均低于野生型（0.70–0.91）。VP81生物膜形成能力增强，而VP82对宿主细胞CT26的黏附能力显著降低。小鼠毒力实验表明，Δ_btuB突变体的LD₅₀高达6.8×10⁸CFU，较野生型（5.6×10⁶CFU）提升121倍，且感染后小鼠体重下降幅度和脾脏菌载量均显著降低。维生素B₁₂摄取实验进一步证实，Δ_btuB在缺B₁₂的M9培养基中生长严重受损，外源添加B₁₂仅部分缓解缺陷。

共进化过程中抗性突变的动态分布

在9天共进化实验中，_btuB基因突变频率始终占主导（91.67%–98.88%），共检测到23个单点突变，其中苏氨酸447和缬氨酸148位点的移码突变出现频率最高（5%–60%），提示这些位点对BtuB蛋白结构稳定性至关重要。而糖基转移酶相关突变未被检出，表明其抗性菌在竞争中被淘汰。

讨论与展望

本研究系统阐明了沙门氏菌通过_btuB突变逃逸噬菌体感染的分子机制，并揭示其伴随的代谢缺陷和毒力衰减这一“适应性权衡”规律。该发现为设计针对维生素B₁₂摄取通路的联合疗法提供了新思路，有望通过精准利用细菌的抗性代价提升噬菌体疗法的可持续性和有效性。