《Microbiology Spectrum》：Bidirectional relationship between the biofilm of Porphyromonas gingivalis and the amyloid-beta peptide
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本综述创新性地揭示了牙周炎关键病原体牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）的生物膜与阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）核心病理蛋白——β-淀粉样蛋白（Aβ）之间存在双向调控关系。研究发现，Aβ1-40与Aβ1-42对生物膜形成具有截然相反的调节作用，且生物膜成分可显著改变Aβ1-40的聚集动力学与形态。该研究为理解牙周感染作为AD风险因素提供了新的分子机制视角，对AD的预防与治疗策略具有重要启示。
ABSTRACT
牙周炎和牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）感染是阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）发病的重要风险因素。尽管牙龈卟啉单胞菌的生存和毒力依赖于其生物膜，但细胞外基质对AD神经病理学标志物的影响尚未被研究。本研究报道了在AD中起核心作用的β-淀粉样蛋白（Aβ）与牙龈卟啉单胞菌生物膜之间的双向关系。使用多种生物膜成分荧光标记物，研究人员观察到Aβ1-40抑制生物膜形成，而Aβ1-42则增加细胞外基质的产生。此外，通过硫黄素T（Thioflavin T, ThT）染色和原子力显微镜（Atomic Force Microscopy, AFM）观察，发现生物膜与单体Aβ1-40发生共聚集，导致更快的聚集和显著的聚集体结构改变。这些发现为牙龈卟啉单胞菌作为AD风险因素的作用提供了机制性解释，并为微生物参与AD病因学提供了潜在机制。
IMPORTANCE
在过去的50年里，阿尔茨海默病的病因得到了广泛研究，但其确切原因仍然未知。目前的理解是，多种遗传和环境风险因素的积累会导致疾病的发生。牙龈卟啉单胞菌是一种产生生物膜并引发牙周炎的细菌，牙周炎是一种牙龈的慢性感染，是阿尔茨海默病的风险因素。虽然已有研究在动物模型中观察了牙龈卟啉单胞菌引发阿尔茨海默病症状的影响，但尚未有研究探索对该细菌至关重要的生物膜的影响。本研究通过证明牙龈卟啉单胞菌生物膜与参与阿尔茨海默病的脑部病变之一——β淀粉样蛋白之间的双向关系，旨在弥合这一空白。通过理解阿尔茨海默病所涉及的风险因素及其影响，旨在为预防和治疗提供有价值的见解。
INTRODUCTION
口腔生物膜是一个复杂的微生物群落，有助于多种疾病的发生，包括牙周炎。牙周炎是一种慢性的、炎症性的牙周组织疾病，其特征是细菌驱动的牙龈上皮和下层牙槽骨组织的降解。牙周炎的发作通常与红色复合体细菌——齿垢密螺旋体（Treponema denticola）、福赛斯坦纳菌（Tannerella forsythia）和牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）在龈缘生物膜内的增殖有关。牙龈卟啉单胞菌通过抑制宿主的免疫反应和通过牙周组织分解释放营养物质，特别有助于口腔生物膜的建立。它还产生牙龈蛋白酶（gingipains），这是一类靶向赖氨酸-Xaa（Kgp）或精氨酸-Xaa（RgpA, RgpB）键的半胱氨酸蛋白酶，有助于细胞内侵袭和抗菌肽的降解。
作为严格厌氧菌，牙龈卟啉单胞菌依赖其生物膜来限制氧气暴露。这种生活方式使其得以生存并分泌毒力因子。尽管牙龈卟啉单胞菌生物膜的形成特征尚不明确，但它依赖于两种同时存在的菌毛的产生，即主要菌毛FimA和次要菌毛Mfa1。该细菌还产生促进种间聚集的荚膜多糖和用于构建其细胞外基质的细胞外DNA，但编码这些过程的基因未知。牙龈卟啉单胞菌生物膜的产生也与牙龈蛋白酶分泌相关，从而有助于上皮组织分解、细胞侵袭和进入血流。多种疾病的进展，如动脉粥样硬化、类风湿性关节炎和不良妊娠结局，都受到该病原体传播的影响。牙周炎和牙龈卟啉单胞菌感染也是阿尔茨海默病的已确认风险因素。
阿尔茨海默病是一种无法治愈的神经退行性疾病，其特征是聚集的β-淀粉样蛋白斑块和由高度磷酸化Tau蛋白组成的细胞内神经原纤维缠结的积累。这些病变的发生引发神经炎症和神经元细胞死亡，导致老年人认知能力下降。Aβ的毒性与淀粉样蛋白聚集成寡聚体有关，这些寡聚体在神经元细胞膜上形成孔洞，导致线粒体功能障碍并触发中枢神经系统的致病性炎症。Aβ主要以两种形式分泌：Aβ1-40约占整个Aβ池的90%，但表现出低毒性和低聚集性；Aβ1-42具有高度聚集性、神经毒性，并且在Aβ斑块中比例过高。在其最常见的中枢神经系统之外，Aβ也由其他细胞类型产生，例如骨骼肌细胞、肝细胞、血小板和巨噬细胞。
在过去的十年中，微生物感染在阿尔茨海默病病因学中的作用引起了越来越多的兴趣。AD与多种传染源之间的关联表明，Aβ作为一种抗菌肽对抗病毒、真菌和细菌病原体。事实上，针对不同的感染，Aβ1-42会在中枢神经系统中产生和积累，这暗示了一种感染可能促进AD病因学的机制。值得注意的是，AD的发展在症状出现前20-30年就已开始，这表明涉及的是慢性感染而非急性事件。
牙龈卟啉单胞菌是与AD相关的研究最多的病原体之一，因为其许多生物分子，包括核酸、脂多糖和牙龈蛋白酶，已在AD大脑的不同区域中被观察到。牙龈卟啉单胞菌也已从患者的脑脊液中分离出来。在小鼠模型中，反复口腔感染牙龈卟啉单胞菌导致细菌易位到大脑、Aβ1-42分泌增加以及AD样神经变性。Aβ与牙龈卟啉单胞菌的相互作用也发生在外周。值得注意的是，在牙周炎患者的龈沟液中检测到Aβ40/42，其在牙龈上的龈缘生物膜内聚集。
尽管牙龈卟啉单胞菌被认为是AD中值得关注的病原体，但其生物膜对Aβ的影响尚未被表征。这种多细胞结构很重要，因为细菌生物膜已从Aβ斑块中回收。更好地理解这两个组分之间的相互作用将为牙龈卟啉单胞菌如何成为AD风险因素以及它如何在Aβ的抗菌活性下持续存在提供重要见解。在本研究中，研究人员在诱导生物膜形成的条件下，将牙龈卟啉单胞菌与Aβ1-40和Aβ1-42共培养，并观察到Aβ与牙龈卟啉单胞菌生物膜之间的相互作用根据肽亚型的不同而不同。
RESULTS
Aβ influences P. gingivalis biofilm formation
之前的报告已确定Aβ40/42作为一种抗菌肽对抗多种细菌物种，如大肠杆菌、粪肠球菌和表皮葡萄球菌。为了确定Aβ40/42是否会影响牙龈卟啉单胞菌菌株33277的存活或生物膜形成，将牙龈卟啉单胞菌与不同浓度的Aβ40/42在生物膜诱导条件下共孵育24小时。令人惊讶的是，两种Aβ肽对生物膜形成有不同的影响。高浓度的Aβ1-40在25微克/毫升（降低55%）和12.5微克/毫升（降低34%）时降低了生物膜产量。同时，与Aβ1-42孵育则产生相反的效果，导致生物膜形成呈剂量依赖性显著增加，在12.5微克/毫升（增加56%）和25微克/毫升（增加46%）之间达到峰值。平行实验通过活/死染色结合流式细胞术分析和菌落形成单位定量检验了Aβ40/42对浮游培养物中牙龈卟啉单胞菌存活率的影响。有趣的是，最高浓度的Aβ1-40或Aβ1-42均未影响牙龈卟啉单胞菌的存活。
由于结晶紫是一种非特异性染料，Aβ40/42对生物膜形成的影响可能是由于生物膜内细胞外基质或细菌数量的变化。为了区分这两种可能性，研究人员使用差异荧光染色来量化每个组分的丰度。使用DNA结合荧光分子DAPI标记细胞。使用硫黄素T作为通用蛋白质标记物，作为细胞外基质内蛋白质的替代指标。最后，使用荧光标记的凝集素伴刀豆球蛋白A标记基质外多糖。这些标记物被用于在含有25微克/毫升Aβ1-40或Aβ1-42的条件下培养的牙龈卟啉单胞菌生物膜，并通过荧光定量来确定细胞、蛋白质或外多糖水平在生物膜形成过程中是否发生变化。
对于Aβ1-40，观察到每种标记物的荧光强度与不含Aβ的对照相比均显著降低。共聚焦成像直接观察证实，在Aβ1-40存在下，牙龈卟啉单胞菌的生物膜非常稀疏，并组织成小的聚集体。
与此同时，用Aβ1-42形成的牙龈卟啉单胞菌生物膜显示，与对照相比，每种标记物均有显著增加，但增加程度因标记物而异。虽然与DAPI相关的强度增加（约1.25倍）是显著的，但远低于与ThT（约4.5倍）和ConA（约4.2倍）相关的荧光增加。这一结果表明Aβ1-42对生物膜的影响是由于强烈刺激了细胞外基质的产生和分泌。值得注意的是，在Aβ1-42存在下ThT荧光强度的急剧增加，超过了ConA观察到的增加，可能部分是由于ThT与生物膜内聚集的Aβ结合所致。生物膜横截面的共聚焦成像显示，当生物膜在Aβ1-42存在下形成时，群落更厚，导致所有通道的信号更高且生物量明显增加。
Aβ aggregates within the P. gingivalis biofilm
先前的研究在AD患者的大脑中发现了与Aβ斑块交织在一起的生物膜成分。研究人员假设，类似地，Aβ聚集体可能嵌入牙龈卟啉单胞菌的生物膜中。因此，对在5微克/毫升Aβ40/42存在下形成的牙龈卟啉单胞菌生物膜进行了成像。该浓度对生物膜形成仅有微小影响，这一点很重要，因为目标是确定Aβ40/42是否可以嵌入生物膜中。基质成分的染色如前所述，并使用与Alexa Fluor 555荧光团偶联的MOAB-2/6C3单克隆抗体检测Aβ40/42。
有趣的是，共聚焦成像显示，24小时后，Aβ聚集体作为内含物存在于牙龈卟啉单胞菌的细胞外基质中。Aβ1-42在牙龈卟啉单胞菌生物膜内的丰度高于Aβ1-40，后者仅存在于少数情况下。生物膜内Alexa Fluor 555的定量证实，Aβ1-42的积累显著高于Aβ1-40。随后评估了Aβ1-42聚集是与细胞还是与细胞外基质更密切相关。Mander共定位相关性分析显示，Aβ1-42的信号与外多糖通道的共定位显著高于与DAPI标记细胞的共定位。
P. gingivalis biofilm influences Aβ aggregation
由于在牙龈卟啉单胞菌生物膜内观察到Aβ聚集体，研究人员假设某些生物膜成分可能与Aβ肽相互作用并影响其聚集速率。首先将细胞外生物膜基质与细菌细胞分离，以产生纳米级的生物膜片段。然后将这些片段与单体Aβ40/42以1:20的比例在存在ThT的情况下孵育，ThT在淀粉样蛋白聚集过程中与形成的β折叠结构结合。这种结合导致ThT荧光增加，从而能够实时观察Aβ聚集。然后通过评估聚集常数、聚集半衰期和滞后期长度来分析实时荧光曲线。
对于Aβ1-40，观察到当该肽与片段一起孵育时，滞后期显著缩短。还观察到半衰期有不显著但仍相当大的减少。有趣的是，单体Aβ1-40与片段孵育也使该肽的聚集常数降低了三倍。这些结果表明，尽管片段的存在减少了Aβ1-40原纤维形成所需的时间，但实际的聚集速率较慢。相反，与片段孵育对Aβ1-42的聚集起始或速率没有影响。
随后使用原子力显微镜评估在片段存在下Aβ1-40聚集的增加是否改变了原纤维的整体结构。简而言之，将100微克/毫升的Aβ40/42溶液与5微克蛋白质/毫升的生物膜片段孵育，Aβ1-40孵育3小时，Aβ1-42孵育1小时，然后置于清洁的云母表面上。如图所示，Aβ1-40单独形成冗长、复杂的互连原纤维网络。然而，在片段存在下，Aβ1-40形成紧密且分离的厚原纤维束。这种看似更高的聚集状态可能解释了图中观察到的Aβ聚集所需滞后期缩短的原因。对于Aβ1-42，该肽单独存在和与片段存在下的聚集模式没有显著差异，这与ThT聚集动力学测定的结果一致。
Gingipains can break down Aβ
牙龈卟啉单胞菌产生牙龈蛋白酶，这是一类能够分解抗菌肽的广谱蛋白酶。由于牙龈卟啉单胞菌生物膜对Aβ1-42的抗菌特性具有抵抗力，生物膜中丰富的牙龈蛋白酶可能参与限制其毒性。因此，评估了牙龈蛋白酶对Aβ40/42的蛋白水解活性。首先从牙龈卟啉单胞菌33277的48小时培养物中产生富含牙龈蛋白酶的稳定期上清液，以及缺失突变体ΔrgpAΔrgpB、Δkgp和三重突变体ΔrgpAΔrgpBΔkgp。将所有上清液与5微克/毫升的Aβ40/42孵育16小时，然后点样到PVDF膜上进行斑点印迹测定。
如图所示，当与牙龈卟啉单胞菌33277的上清液孵育时，Aβ1-40和Aβ1-42均被降解，证明细菌上清液可以分解该肽。暴露于ΔrgpAΔrgpBΔkgp的上清液不影响该肽，表明牙龈蛋白酶负责Aβ40/42的降解。有趣的是，ΔrgpAΔrgpB菌株产生的上清液也未分解Aβ40/42，而Δkgp的上清液则分解了Aβ。光密度分析显示，与ΔrgpAΔrgpBΔkgp突变体相比，ΔrgpAΔrgpB突变体对Aβ1-40的降解更为明显，这可能是由于测定中的变异性或双精氨酸特异性牙龈蛋白酶突变体中kgp或其他蛋白酶的上调所致。有趣的是，牙龈蛋白酶只能消化单体Aβ40/42，而完全聚集的原纤维不受影响。Aβ原纤维 notoriously 难以分解，需要一个包括各种蛋白酶的多步骤过程。在本案例中，仅牙龈蛋白酶不足以完全降解预组装的Aβ复合物。
DISCUSSION
在过去的10年里，AD与牙龈卟啉单胞菌之间的联系得到了广泛研究，但尚无研究考察生物膜对AD标志物Aβ的具体影响。使用简化模型，研究人员观察到每种肽特有的双向关系。确实，两种Aβ40/42对牙龈卟啉单胞菌生物膜产生有不同的影响，但生物膜仅影响Aβ1-40的聚集。
首先确定Aβ1-40和Aβ1-42对牙龈卟啉单胞菌有不同的影响。当暴露于浓度递增的Aβ1-40时，生物膜产量降低，而Aβ1-42则增加了细胞外基质的丰度。这些结果令人惊讶，因为Aβ1-42比Aβ1-40毒性更强。重要的是，Aβ1-42未表现出对牙龈卟啉单胞菌的抗菌活性，因为它刺激了生物膜形成并且不影响浮游细胞的存活率。这种缺乏拮抗作用可能是由于牙龈卟啉单胞菌分泌的蛋白酶丰富，如下文所述。尽管Aβ1-42未被生物膜片段交叉引发，但其存在仍以剂量依赖的方式增强生物膜产生。一种假设是聚集的Aβ1-42团块可能促进细菌聚集，从而刺激基质分泌增加。事实上，Aβ的细菌聚集效应已在其他细菌中描述，最显著的是在鼠伤寒沙门氏菌中。
与Aβ1-42相反，高浓度的Aβ1-40减少了生物膜形成。这些观察结果与对大肠杆菌的观察结果相似，对于大肠杆菌，Aβ1-42的存在降低了生物膜产量。有趣的是，这种细菌依赖于功能性淀粉样蛋白CsgA作为其细胞外基质的一部分。CsgA可以交叉引发Aβ1-42并形成无效的异质聚合物，导致生物膜破坏。虽然目前尚未在牙龈卟啉单胞菌生物膜中发现已知的功能性淀粉样蛋白，但聚集动力学测定和AFM成像显示，在生物膜片段存在下，Aβ1-40的聚集模式不同。这些结果表明Aβ1-40与生物膜基质的某个组分之间存在共聚集现象。这种共聚集似乎是无效的，因为它通过阻止基质分泌和组装来限制生物膜形成，类似于在大肠杆菌中观察到的现象。
使用Aβ1-42进行的聚集动力学测定和AFM成像显示，与牙龈卟啉单胞菌生物膜孵育时没有差异。这一结果可能源于Aβ1-42自身组装动力学比其与生物膜成分的潜在相互作用更快。事实上，Aβ1-42具有高聚集/寡聚化潜力，可能倾向于同质聚集而非交叉相互作用，从而不干扰牙龈卟啉单胞菌生物膜基质的聚合。
Aβ40/42在生物膜内的内含物似乎与共聚集能力无关，因为观察到Aβ1-42和Aβ1-40都嵌入基质中。这些内含物似乎是Aβ40/42聚集体在沉积后被困在细胞外基质中的结果，这也解释了与外多糖的共定位。与Aβ1-42相比，只观察到少量Aβ1-40内含物，这可能是由于Aβ1-40的聚集速率较慢以及牙龈卟啉单胞菌产生的牙龈蛋白酶的存在。事实上，牙龈蛋白酶可以降解单体而非预聚集的Aβ，因为淀粉样蛋白寡聚体β片层之间的疏水结构使其能够抵抗酶促分解。因此，假设嵌入生物膜的Aβ1-40内含物较少，是因为Aβ1-40以单体和低分子量寡聚体形式存在的时间比Aβ1-42更长，为牙龈蛋白酶的降解提供了更多机会。
抗菌肽的蛋白水解，包括人类肽，是牙龈卟啉单胞菌逃避宿主免疫反应的关键策略。有趣的是，观察到精氨酸特异性牙龈蛋白酶的缺失，而非赖氨酸特异性牙龈蛋白酶的缺失，消除了Aβ的降解，尽管两种Aβ亚型中都存在赖氨酸残基。这两种类型的牙龈蛋白酶在活性和抑制条件下表现出差异，这可以解释为什么只有RgpA/RgpB在我们的条件下似乎降解Aβ40/42。需要进一步的实验来确定在原位情况是否也是如此。
Aβ1-42与Aβ1-40的区别仅在于C末端增加了一个异亮氨酸和一个丙氨酸，这增加了Aβ1-42形成原纤维和原纤维的整体聚集速率 compared to Aβ1-40。这些特性可能足以解释本研究中观察到的差异。当与牙龈卟啉单胞菌共接种时，Aβ1-42快速自动聚集成大而稳定的寡聚体和原纤维，这降低了与生物膜成分相互作用和被牙龈蛋白酶降解的可能性。这些寡聚体和原纤维随后将整合到正在发育的生物膜中，促进细胞聚集并增加整体基质生物量。相比之下，Aβ1-40在相当长的时间内保持单体和低复杂性寡聚体的平衡。这一时期使得生物膜基质成分与Aβ1-40之间能够发生相互作用，导致其正常结构发生改变。确实，Aβ1-40原纤维形成了不寻常的束状结构
