《Microbiology Spectrum》：Mutation of the highly conserved amino acids in the N-terminal region of the EV-A71 VP1 protein impairs viral RNA release during virus entry
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本研究系统揭示了肠道病毒A71（EV-A71）衣壳蛋白VP1 N端71个氨基酸中7个完全保守的残基（T32、A46、M63、E65、T66、L70、N71）在病毒进入过程中的关键作用。通过反向遗传学与功能实验，发现突变任一残基均会破坏VP1与VP2/VP3间的氢键及疏水网络，阻碍衣壳解离（uncoating）和病毒RNA释放，导致病毒不可逆失活。该研究为开发靶向VP1 N端的广谱抗病毒药物及减毒疫苗提供了关键分子基础。
EV-A71 VP1蛋白高度保守氨基酸的功能解析
引言
肠道病毒A71（EV-A71）是亚太地区手足口病（HFMD）的主要病原体，感染可引发儿童严重神经系统并发症。病毒衣壳由VP1-VP4四种蛋白构成，其中VP1作为最外露的免疫优势蛋白，其N端区域（氨基酸1-71）在病毒进入过程中从衣壳内部移位至表面，驱动衣壳解离和病毒RNA释放。然而，VP1中维持这一关键功能的遗传决定簇尚未明确。
21个高度保守氨基酸的分布与功能
研究团队通过分析3,777株EV-A71的VP1序列，鉴定出21个基因型间完全保守的氨基酸位点（CGHCS）。空间定位显示这些位点主要富集于VP1序列前2/3区域，其中17个暴露于蛋白表面，邻近SCARB2受体、硫酸乙酰肝素（HS）结合位点或口袋因子（pocket factor）结构域。功能实验表明，除S168A突变体外，其余20个保守氨基酸的突变均显著影响病毒复制：12个突变（包括N端7个残基）完全致死，8个突变使病毒滴度下降103-107倍。
N端7个保守氨基酸的不可逆致死效应
位于VP1 N端的T32、A46、M63、E65、T66、L70和N71残基突变后，病毒无法在Vero细胞中连续传代恢复活性。突变体在细胞内可正常转录病毒RNA并合成结构蛋白（如VP0/VP2），但病毒粒子产量部分降低（如N71A突变使病毒RNA减少5倍）。透射电镜与Western blot证实突变体可组装病毒颗粒，但其感染性完全丧失。
病毒进入机制的多环节缺陷
进一步机制研究表明，突变体在病毒附着环节即出现差异：T32A和A46T突变体结合细胞能力与野生型无异，而C端邻近突变（如N71A）则使细胞附着率下降90%。通过RNA荧光原位杂交（FISH）动态监测病毒进入过程，发现野生型病毒在感染30分钟后胞内RNA斑点数达15.7个/细胞，而所有N端突变体均无法检测到RNA释放信号。负链RNA检测结果证实，突变体在感染6小时后仍无基因组复制迹象。
结构基础：氢键与疏水网络破坏
基于3VBS晶体结构的模拟显示，7个保守残基通过氢键和疏水相互作用稳定衣壳原聚体结构。这些突变分为两类作用模式：
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Cluster I（A46T、M63A、N71A）：破坏VP1与VP3 GH环（残基170-192）的相互作用，如M63A突变消除7个疏水键，阻碍该环在衣壳扩张时从α螺旋向β发夹的构象转换；
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Cluster II（T32A、E65A、T66A、L70A）：干扰VP1与相邻原聚体VP2桥区（残基48-52）的联接，如L70A突变削弱VP1-N31与VP2-S45的疏水接触，抑制二重轴通道的开放。
自由能计算（ΔΔG）进一步揭示，T32A等5个突变降低结构刚性，而E65A和N71A则增强柔性，均阻碍衣壳解离所需的协同构象变化。
讨论与应用前景
本研究首次系统证实VP1 N端保守氨基酸通过维持VP1-VP2/VP3界面稳定性，调控病毒衣壳解离和RNA释放。该区域相较于VP1其他部位具有更高保守性，提示其可作为广谱抗EV-A71药物的靶点。突变这些位点构建的减毒株因无法回复突变而具备疫苗开发潜力。研究策略为探索其他小RNA病毒衣壳蛋白功能提供了范式。
